崔敏，郭冉，夏輝

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北秦皇島066000)

大菱鲆Scophthatmus maximus俗稱多寶魚，其生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩、口感獨(dú)特，是中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖種類之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2009年中國(guó)鲆鰈類總產(chǎn)量為7.9～8.9萬(wàn)t，其中總產(chǎn)量的92%來(lái)自山東、河北、天津、遼寧4個(gè)環(huán)渤海灣主產(chǎn)區(qū)，大菱鲆產(chǎn)量占到總產(chǎn)量的55%，2010年大菱鲆的產(chǎn)量達(dá)到 5 萬(wàn) t［1］。

大菱鲆對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的需求量較高，尤其是幼魚。當(dāng)飼料中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于39%時(shí)，幼魚生長(zhǎng)緩慢;只有當(dāng)?shù)鞍椎馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于42%時(shí)，大菱鲆幼魚才會(huì)快速生長(zhǎng)［2］。眾所周知，在水產(chǎn)動(dòng)物的飼料原料中，最緊缺的就是飼料蛋白源，積極開發(fā)飼料蛋白源具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。目前，對(duì)漁用蛋白源的研究主要集中在動(dòng)物性蛋白源、植物性蛋白源、單細(xì)胞蛋白源等幾個(gè)方面。本試驗(yàn)中所使用的飼料酵母屬單細(xì)胞蛋白，它是以淀粉企業(yè)生產(chǎn)淀粉和葡萄糖的廢棄物為底物，以產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilis為菌種，經(jīng)過(guò)一系列的發(fā)酵、蒸干、噴霧干燥等工藝加工而成。該飼料酵母中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)46.36%，粗脂肪、粗纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.71%和0.04%，總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.04%，賴氨酸含量較高，蛋氨酸含量較少，營(yíng)養(yǎng)十分豐富。如能充分利用該飼料酵母作為蛋白來(lái)源最大限度地替代魚粉，不僅可以減少魚粉的使用量，降低生產(chǎn)成本，還能充分利用中國(guó)的糟渣資源，解決環(huán)境污染問(wèn)題。

目前關(guān)于飼料酵母對(duì)魚類生長(zhǎng)影響的研究較多，大多集中在用飼料酵母替代魚粉后對(duì)魚類的增重率、飼料系數(shù)等指標(biāo)的影響，研究對(duì)象多為鯉Cyprinus carpio［3］、建 鯉 Cyprinus carpiovar jian［4］、羅 非 魚 Oreochromis mossambicus［5］和 淡 水 白 鯧Ephippusorbis［6］等。免疫學(xué)指標(biāo)是魚類生理學(xué)、營(yíng)養(yǎng)與飼料的主要研究?jī)?nèi)容之一。酶活力是反映魚類免疫機(jī)能的重要指標(biāo)。目前，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)指標(biāo)的探索主要集中在酵母培養(yǎng)物、酵母細(xì)胞壁和酵母膏上［7-10］，但飼料酵母對(duì)大菱鲆免疫機(jī)能的影響還未見系統(tǒng)的報(bào)道。本研究中，作者采用營(yíng)養(yǎng)學(xué)和免疫學(xué)方法，探索飼料酵母替代魚粉的可行性及其在大菱鲆飼料中適宜的添加比例，以期為飼料酵母的應(yīng)用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

大菱鲆幼魚購(gòu)于秦皇島天合水產(chǎn)良種有限公司，體質(zhì)量為 (9.02 g±0.15 g)，共195尾。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的配制 試驗(yàn)中所用魚粉為秘魯魚粉，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68%。飼料酵母由秦皇島驪驊淀粉股份有限公司生產(chǎn)和提供，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.36%。試驗(yàn)中分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、15%、30%、45%、60%的飼料酵母替代飼料中0、17%、34%、51%、68%的魚粉，配制成5種等氮、等能的試驗(yàn)飼料，分別記為Ⅰ (對(duì)照組)、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組。飼料配方及飼料的營(yíng)養(yǎng)成分見表1。根據(jù)飼料配方將所有飼料原料用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)80目篩，混勻，擠壓成直徑為1.5 mm的硬顆粒飼料，干燥后密封于冰箱 (-20℃)中保存，備用。

表1 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)成分Tab.1 The ingredients and composition of the experimental diets w/%

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

將大菱鲆幼魚隨機(jī)分為5組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)組放養(yǎng)13尾魚。試驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)流水的水族箱 (60 cm×40 cm×50 cm)中進(jìn)行，內(nèi)盛水120 L，用試驗(yàn)飼料馴化10 d后開始試驗(yàn)。試驗(yàn)期間，水溫為 (18.0±1.0)℃，pH為 (7.6±0.4)，溶氧大于8 mg/L，鹽度為 (30.60±0.02)。每天飼喂3次 (7:00、12:00和18:00)，投飼率為體質(zhì)量的3%～4%。每14 d調(diào)整一次投喂量，試驗(yàn)持續(xù)56 d。

1.2.3 樣品的采集 試驗(yàn)結(jié)束后，禁食1 d，每箱隨機(jī)取3尾魚稱重，置于105℃下烘干［11］，然后用微型粉碎機(jī)粉碎、稱重，裝入密封袋中并置于冰箱(-20℃)中冷凍保存，用于測(cè)定其粗蛋白、粗灰分和粗脂肪含量［12-13］。另從每箱中隨機(jī)取3尾魚，麻醉處理后，測(cè)其體長(zhǎng)和體質(zhì)量，然后用2.5 mL一次性無(wú)菌注射器 (含肝素鈉)從心臟采血，并置于冰箱 (4℃)中過(guò)夜，以3 000 r/min于4℃下離心10 min，分離血漿，將收集的血漿保存于冰箱(-80℃)中，待測(cè)。

1.2.4 體成分的測(cè)定 飼料及魚體成分均采用國(guó)標(biāo)中的方法測(cè)定。采用105℃烘箱干燥法測(cè)定干物質(zhì)的質(zhì)量，采用馬弗爐灼燒法 (550℃)測(cè)定粗灰分含量，采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量，采用索氏抽提法 (以石油醚為溶劑)測(cè)定粗脂肪含量［14］。

1.2.5 生化指標(biāo)的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定血漿中的總蛋白，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶 (super oxide dismutase，SOD)的活力，采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定堿性磷酸酶 (alka-line phosphatase，AKP)的活力，參照 Yin等［15］的方法測(cè)定溶菌酶 (lysozyme)的活力，以上指標(biāo)均用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。測(cè)定殺菌活性 (bactericidal activity)時(shí)，以大腸桿菌為底物，在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，用0.067 mol/L的PBS(pH 6.4)洗滌成菌懸液，使其OD570nm≈0.3。取2 mL配制好的大腸桿菌菌懸液放入試管中，加入20 μL血漿，混勻，測(cè)其吸光度A0;然后將試管移入37℃下水浴30 min，取出后立即冰浴10 min，測(cè)其吸光度A，用下列公式計(jì)算殺菌活性 (UL):

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (mean±S.E.)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析 (One-way ANOVA)，若組間差異顯著，再用Duncan's法進(jìn)行多重比較，顯著水平為0.05。

增重率=(末均質(zhì)量-初均質(zhì)量)/初均質(zhì)量×100%，

特定生長(zhǎng)率=(ln末體質(zhì)量-ln初體質(zhì)量)/試驗(yàn)天數(shù)×100%，

成活率=(試驗(yàn)?zāi)~尾數(shù)/試驗(yàn)初魚尾數(shù))×100%，

飼料系數(shù)=攝食飼料總量/魚體增重量，

蛋白質(zhì)效率=魚體增重量/蛋白質(zhì)攝取量，

肝體指數(shù)=肝臟質(zhì)量/魚體質(zhì)量×100%，

內(nèi)臟指數(shù)=內(nèi)臟質(zhì)量/魚體質(zhì)量×100%，

肥滿度=體質(zhì)量(g)/體長(zhǎng)3(cm)×100%。

2 結(jié)果

2.1 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)性能的影響

從表2可見:Ⅱ組大菱鲆幼魚的增重率和特定生長(zhǎng)率均最高，但與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異 (P＞0.05);Ⅱ組幼魚的飼料系數(shù)最低，Ⅴ組幼魚的飼料系數(shù)最高，除Ⅴ組與對(duì)照組差異顯著 (P＜0.05)外，其余試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異均不顯著 (P＞0.05);Ⅱ組幼魚的蛋白質(zhì)效率最高，除Ⅳ、Ⅴ組顯著低于對(duì)照組外 (P＜0.05)，其余試驗(yàn)組與對(duì)照之間的差異均不顯著 (P＞0.05);Ⅱ組和Ⅳ組幼魚的成活率比對(duì)照組顯著提高15.15%和12.11%(P＜0.05)，而Ⅴ組比對(duì)照組顯著降低12.12%(P ＜0.05)。

表2 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)性能及飼料利用的影響Tab.2 The effects of partial replacement of fish meal by feed yeast on growth performance and feed conversion in turbot Scophthalmus maximus

2.2 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚形體指標(biāo)的影響

從表3可見:Ⅱ組與Ⅲ組大菱鲆幼魚的肝體指數(shù)分別比對(duì)照組顯著提高83.08%和61.54%(P＜0.05)，Ⅳ組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05)，而Ⅴ組幼魚的肝體指數(shù)比對(duì)照組顯著降低69.23%(P＜0.05);Ⅱ組幼魚的內(nèi)臟指數(shù)比對(duì)照組顯著提高24.60%(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組和Ⅴ組與對(duì)照組差異均不顯著 (P＞0.05);Ⅱ組和Ⅴ組幼魚的肥滿度與對(duì)照組無(wú)顯著差異 (P＞0.05)，Ⅲ、Ⅳ組幼魚的肥滿度分別比對(duì)照組提高15.74%和12.99%(P＜0.05)，但Ⅲ、Ⅳ組之間差異不顯著 (P＞0.05)。

2.3 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚體成分的影響

由表3可見:全魚水分和粗脂肪含量隨著替代比例的增加沒(méi)有顯著性差異 (P＞0.05);Ⅱ組大菱鲆幼魚的粗蛋白含量顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)，Ⅲ組與對(duì)照組差異不顯著 (P＞0.05)，Ⅳ組和Ⅴ組顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);Ⅱ組大菱鲆幼魚的灰分含量顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的灰分含量則分別高于對(duì)照組12.82%、22.01%和23.07%(P＜0.05)，但Ⅳ組和Ⅴ組之間無(wú)顯著差異 (P＞0.05)。

表3 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚形體指標(biāo)和體成分的影響Tab.3 The effects of partial replacement of fish meal by feed yeast on morphological indicators，and whole body composition in turbot Scophthalmus maximus %

2.4 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚免疫機(jī)能的影響

從表4可見:隨著替代比例的增加，各試驗(yàn)組與對(duì)照組大菱鲆幼魚血清中堿性磷酸酶的活性和殺菌活性差異均不顯著 (P＞0.05);Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組幼魚血清中溶菌酶的活性與Ⅳ、Ⅴ組之間差異均顯著 (P＜0.05)，其余組間均無(wú)顯著差異 (P＞0.05);Ⅱ組幼魚血清中超氧化物岐化酶活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異 (P＞0.05)，Ⅲ、Ⅳ組和Ⅴ組均比對(duì)照組低29.32%、27.20%和34.15% (P＜0.05)，其余組間均無(wú)顯著差異 (P＞0.05);Ⅱ組和Ⅲ組幼魚血漿中的蛋白含量與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)，Ⅳ組和Ⅴ組比對(duì)照組降低32.47%和35.55%(P＜0.05)，其余組間均無(wú)顯著差異 (P＞0.05)。

表4 用不同比例的飼料酵母替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚免疫機(jī)能的影響Tab.4 The effects of partial replacement of fish meal by feed yeast on immune efficiency in turbot Scophthalmus maximus

3 討論

諸多研究表明［16-20］，在魚類飼料中，用飼料酵母部分或全部替代魚粉是可行的，但是要根據(jù)養(yǎng)殖魚的種類和食性的差異來(lái)調(diào)整飼料配方，以滿足魚類對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求。本試驗(yàn)中，用飼料酵母替代17%的魚粉 (Ⅱ組)時(shí)，大菱鲆幼魚的生長(zhǎng)性能最佳。這與張梁等［6］網(wǎng)箱養(yǎng)殖淡水白鯧的結(jié)果相同。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅱ組大菱鲆幼魚的成活率、增重率、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率最高，但幼魚的增重率、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率均隨飼料酵母替代比例的升高而下降。這說(shuō)明適量的酵母有利于大菱鲆幼魚的生長(zhǎng)，但隨著飼料中酵母含量的增加會(huì)影響大菱鲆幼魚對(duì)飼料的轉(zhuǎn)化率，從而導(dǎo)致大菱鲆幼魚的增重率和成活率下降。但葛樹立等［5］用活性酵母養(yǎng)殖羅非魚時(shí)，隨著替代比例的增加，試驗(yàn)魚的增重率增加，飼料系數(shù)降低，表明活性酵母可以明顯促進(jìn)羅非魚的生長(zhǎng)。其原因可能與養(yǎng)殖魚的種類以及酵母的來(lái)源、組成等有關(guān)。用較高比例的飼料酵母替代魚粉時(shí)，也同樣降低了鯉［3］、淡水白鯧［6］、胡子鯰［19］的攝食與生長(zhǎng)，這可能是高濃度的飼料酵母引起魚體的免疫反應(yīng)過(guò)度，導(dǎo)致用于生長(zhǎng)的能量和營(yíng)養(yǎng)素減少的緣故。Rumsey等［21］則認(rèn)為，完整的酵母細(xì)胞因存在細(xì)胞壁，無(wú)法使胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分釋放出來(lái)，因而魚類利用高含量酵母的能力較差。

幼魚的消化系統(tǒng)發(fā)育不及成魚完善，對(duì)各種環(huán)境因子 (運(yùn)輸、儲(chǔ)藏、食物因子、水質(zhì)理化因子等)尤其是食物因子的變化反應(yīng)比較敏感，當(dāng)飼料中添加大量飼料酵母時(shí)，可能會(huì)對(duì)消化系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，肝體指數(shù)和內(nèi)臟指數(shù)會(huì)發(fā)生較大變化。本試驗(yàn)中，Ⅱ組大菱鲆幼魚的肝體指數(shù)、肥滿度和內(nèi)臟指數(shù)均高于對(duì)照組，說(shuō)明一定比例的飼料酵母會(huì)刺激魚體形體的生長(zhǎng)，改善肝功能。但黃鈞等［5］用加酶飼料酵母替代魚粉飼養(yǎng)豐鯉時(shí)，魚粉組的肥滿度顯著高于各飼料酵母替代組。

隨著飼料酵母替代比例的增加，全魚的水分和脂肪含量無(wú)明顯變化，粗蛋白含量逐漸降低，灰分含量逐漸升高。當(dāng)用飼料酵母替代魚粉的比例為51%(Ⅳ組)和68%(Ⅴ組)時(shí)，大菱鲆幼魚的粗蛋白含量顯著下降，表明用飼料酵母替代魚粉的比例過(guò)高時(shí)會(huì)影響蛋白質(zhì)在魚體內(nèi)的沉積，這與高含量飼料酵母組的幼魚對(duì)飼料的利用率較低有關(guān)。總體來(lái)看，Ⅱ組幼魚的粗蛋白含量最高，顯著高于對(duì)照組，而其粗脂肪含量又最低，說(shuō)明飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的飼料酵母能夠增加魚體的蛋白質(zhì)含量，減少脂肪的堆積，顯著提高了魚肉的品質(zhì)，使魚肉更加鮮嫩可口。

溶菌酶廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的許多組織和體液中，是殺滅病原菌的物質(zhì)基礎(chǔ)。血漿中的溶菌酶主要來(lái)自血細(xì)胞，是一種堿性球蛋白，能夠?qū)Ｒ恍缘厮怆亩嗵欠肿又笑?1，4糖苷鍵，從而破壞并裂解細(xì)胞壁，最終使細(xì)菌死亡，實(shí)現(xiàn)其機(jī)體的防御功能［22-23］。測(cè)定魚體的溶菌酶活性，可以在一定程度上反映魚類非特異性體液的免疫狀態(tài)。

血漿中的蛋白，如免疫球蛋白 (IgM)、補(bǔ)體等蛋白含量以及殺菌活性也可以作為魚類的免疫指標(biāo)。本試驗(yàn)中，各組間幼魚的殺菌活性沒(méi)有顯著性差異，而血漿中的蛋白含量和溶菌酶含量均是Ⅱ組最高，當(dāng)用飼料酵母替代魚粉的比例增加時(shí)，幼魚的殺菌活性反而下降。這說(shuō)明飼料酵母可能會(huì)抑制血漿中的蛋白生成和溶菌酶的活性。但有些研究結(jié)果與此相反，如Baulny等［24］曾報(bào)道，酵母β-葡聚糖能增強(qiáng)大菱鲆的溶菌酶活性;陳超然等［9］的研究表明，各試驗(yàn)組魚體血清中總蛋白的含量隨著酵母β-葡聚糖添加量的增加而提高。

堿性磷酸酶是一種非特異性磷酸水解酶，能催化磷酸單脂的水解及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，對(duì)動(dòng)物生存具有重要的意義。本試驗(yàn)中，隨著飼料酵母添加比例的增加，堿性磷酸酶酶活性沒(méi)有顯著性的差異。而胡火庚等［8］的研究表明，隨著酵母復(fù)合物添加量的增加，中華絨螯蟹血清中堿性磷酸酶的活性顯著上升，表明酵母復(fù)合物對(duì)中華絨螯蟹的非特異免疫力有增強(qiáng)作用。

超氧化物歧化酶具有催化超氧離子自由基進(jìn)行歧化反應(yīng)的功能，是機(jī)體清除氧自由基的重要抗氧化保護(hù)酶，它能使自由基的形成和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡，從而清除自由基對(duì)機(jī)體的危害，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。當(dāng)SOD活性降低時(shí)，其自由基等毒害物質(zhì)就會(huì)積累。本試驗(yàn)中，血漿中的蛋白含量和SOD活性也都隨著飼料酵母添加比例的增加而減少，說(shuō)明添加高比例的飼料酵母可以減弱機(jī)體的免疫能力，這可能也是導(dǎo)致Ⅴ組死亡率增加的重要原因之一。然而，一些國(guó)外專家認(rèn)為，飼料酵母同益生菌有同樣的效果，可以提高動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抵抗微生物入侵的能力。關(guān)于飼料酵母對(duì)大菱鲆免疫因子的影響還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，用飼料酵母替代飼料中17%左右的魚粉時(shí)，可以使大菱鲆的生長(zhǎng)、成活率、機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分和免疫機(jī)能優(yōu)于其它各組。

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