劉志丹，李霞，秦艷杰

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

種質(zhì)細(xì)胞冷凍保存始于20世紀(jì)50年代［1］，該技術(shù)發(fā)展至今已取得很大成就。其中哺乳動(dòng)物精子冷凍保存發(fā)展比較成熟，在人類生殖和畜牧業(yè)良種生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用，如精子庫的建立。關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物精子的超低溫冷凍保存技術(shù)國內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了研究，報(bào)道較多的為魚類和貝類［2-7］。目前，關(guān)于海膽精子超低溫保存技術(shù)的研究國外已有報(bào)道［8-9］，而關(guān)于中間球海膽 Strongylocentrotus intermedius冷凍保存技術(shù)的研究卻很少，僅見王笑月等［10］對(duì)此進(jìn)行了初步研究。

中間球海膽的味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值較高，因而深受國內(nèi)外市場(chǎng)的歡迎，現(xiàn)已成為中國北方海水養(yǎng)殖的主要種類之一。自20世紀(jì)90年代從日本引進(jìn)中間球海膽后，由于近親交配和環(huán)境等因素的影響，造成該種質(zhì)退化并出現(xiàn)病害等問題，所以每年需從原產(chǎn)地引種。然而，大規(guī)模的運(yùn)輸帶來費(fèi)用提高、種膽死亡以及繁瑣的檢疫等一系列問題，而建立海膽精子庫則可以解決上述難題，同時(shí)對(duì)海膽種質(zhì)資源的保存也有一定的意義。本試驗(yàn)中，作者研究了用超低溫冷凍方法保存中間球海膽精子，以期為中間球海膽精子庫的建立提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

種海膽于2009年5—6月取自大連新碧龍海產(chǎn)有限公司，選取性腺發(fā)育成熟的中間球海膽，在實(shí)驗(yàn)室中暫養(yǎng)，每日換水一次，換水量為1/2。

從中間球海膽圍口膜處注射0.075 mol/L KCl 1 mL，然后單個(gè)放在50 mL燒杯上，待精卵產(chǎn)出后分別收集。

1.2 方法

1.2.1 不同降溫方式對(duì)精子存活率和受精率的影響試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將鮮精液與用煮沸消毒海水配制的DMSO(體積分?jǐn)?shù)為10%)冷凍保存液按體積比1∶1混合后裝入1.8 mL凍存管中。將凍存管放入冰箱 (4℃)內(nèi)平衡10 min后，懸于液氮面上方進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷方式分為4組:D1組，于液氮面上方3 cm(約-160℃)處停留8 min;D2組，于液氮面上方15 cm(約-60℃)處停留8 min;D3組，于液氮面上方15、3 cm處分別停留3 min和5 min;D4組，直接浸入液氮(-196℃)中，預(yù)冷后將各組凍存管均浸入液氮中，24 h后解凍，觀察精子的存活率和受精率。

1.2.2 冷凍保存液的篩選 根據(jù)“1.2.1”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，以煮沸消毒海水為基礎(chǔ)液添加不同濃度的DMSO、甘油、海藻糖配制成不同濃度的冷凍保護(hù)液，分別記為對(duì)照組、A1～A13組。將不同濃度的冷凍保護(hù)液與鮮精液按體積比1∶1混合裝入1.8 mL凍存管中，于冰箱 (4℃)內(nèi)平衡10 min，然后在液氮面上方15、3 cm處分別停留3 min和5 min，最后浸入液氮中保存。24 h后解凍，統(tǒng)計(jì)精子的存活率和受精率。冷凍保護(hù)液配方見表1。

表1 冷凍保護(hù)液的配方Tab.1 Formula of antifreezers

1.2.3 平衡時(shí)間的選擇 將鮮精液與A11冷凍保護(hù)液按體積比1∶1混合后裝入1.8 mL凍存管中，最終體積為1 mL。將凍存管于冰箱 (4℃)中分別平衡0、5、10、15、20、30 min，取出后在液氮面上方15、3 cm處分別停留3 min和5 min，然后將凍存管浸入液氮中，24 h后取出凍存管解凍，統(tǒng)計(jì)精子的存活率和受精率。

1.2.4 葡萄糖對(duì)精子受精率的影響 將鮮精液與抗凍液A11按1∶1混合后，于冰箱 (4℃)內(nèi)平衡15 min，按照“1.2.1”節(jié)中D3組的降溫方式冷凍，冷凍保存24 h后解凍，統(tǒng)計(jì)精子的存活率后進(jìn)行受精。將精子放入受精海水中，分別加入濃度為0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖 (分別記為A、B、C、D、E組)，統(tǒng)計(jì)精子的受精率。

1.2.5 解凍 解凍時(shí)將浸入液氮內(nèi)的凍存管取出，懸于液氮面上方15 cm處平衡5 min，然后迅速放入水浴鍋中 (22±2℃)解凍。

1.2.6 存活率、受精率的統(tǒng)計(jì) 用5 g/L的臺(tái)盼藍(lán)于室溫下染色15 min，在顯微鏡下觀察精子的存活率。死亡精子的頂體部或核體部呈藍(lán)色，活精子不著色。每次統(tǒng)計(jì)200個(gè)精子，重復(fù)3次［11］，計(jì)算存活率:

將解凍后的精子與新鮮卵子混合受精，精子與卵子的比例為1 000∶1。每次統(tǒng)計(jì)100個(gè)卵子，重復(fù)3次，計(jì)算其受精率。受精率以發(fā)育至原腸胚的卵子數(shù)占全部統(tǒng)計(jì)數(shù)的百分比來表示。

上述試驗(yàn)選取新鮮精子的存活率均在90%以上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用One Way-ANOVA法進(jìn)行方差分析，若差異顯著則采用Ducan's多重比較方法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 降溫方式對(duì)精子存活率和受精率的影響

從表2可見:采用在液氮面上方15、3 cm處分別停留3 min和5 min(D3組)的降溫方式對(duì)精子的冷凍效果好于其他組，精子的存活率和受精率分別為24.7%±3.8%和8.3%±2.5%，而直接浸入液氮中 (D4組)的效果最差。

表2 不同降溫方式對(duì)冷凍精子存活率和受精率的影響(n=3)Tab.2 Effect of different freezing ways on post-thawed sperm survival rate and fertilization rate(n=3)

2.2 冷凍保護(hù)液的篩選

本試驗(yàn)結(jié)果表明:隨著甘油添加量的增加，A1～A9試驗(yàn)組精子解凍后的存活率和受精率先增加后下降，其中A4試驗(yàn)組凍存效果最好，冷凍后精子存活率和受精率分別為48.83%±2.40%和15.37%±10.00%;在A4組冷凍保護(hù)液基礎(chǔ)上添加適量海藻糖能夠提高冷凍后精子的存活率和受精率，海藻糖添加的最佳濃度為25 mmol/L，在添加此濃度的抗凍液 (A11)組中精子的存活率和受精率最高，分別達(dá)到54.2%±4.4%和23.0%±3.2%(圖1)。

圖1 抗凍保護(hù)液對(duì)冷凍精子存活率和受精率的影響Fig.1 Effect of cryoprptectant type on post-thawed sperm survival rate and fertilization rate

2.3 平衡時(shí)間對(duì)精子冷凍效果的影響

從表3可見:冷凍精子解凍后的存活率和受精率均隨平衡時(shí)間的增加先上升后下降，平衡時(shí)間為15 min時(shí)，精子的存活率和受精率達(dá)到最高，分別為58.2%±4.0%和24.7%±2.9%。平衡時(shí)間為15 min的冷凍精子與平衡時(shí)間為20、40 min的兩組冷凍精子相比，解凍后精子的存活率變化不顯著(P＞0.05)，但受精率卻顯著下降 (P＜0.05)。

表3 4℃下平衡時(shí)間對(duì)冷凍精子存活率和受精率的影響Tab.3 Effect of equilibration time at 4℃on postthawed sperm survival rate and fertilization rate

2.4 添加葡萄糖對(duì)冷凍精子受精率的影響

從表4可見:精子冷凍后在受精液中添加適量的葡萄糖有助于提高精子的受精率，其中C組受精率最高 (29.0% ±0.6%)，顯著高于對(duì)照組(A組)(23.0% ±1.0%)(P＜0.05)，而E組(15.7%±2.1%)卻顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，其它試驗(yàn)組與對(duì)照組差異均不顯著(P＞0.05)。

表4 葡萄糖對(duì)解凍后精子受精率的影響Tab.4 Effect of glucose on post-thawed sperm fertilization rate

3 討論

3.1 降溫方式對(duì)精子凍存效果的影響

降溫方式從速率上大致分為慢速冷凍和快速冷凍。由于快速冷凍與慢速冷凍相比，不易形成大冰晶，對(duì)細(xì)胞的損傷較小，現(xiàn)已被多數(shù)學(xué)者采用［2-6］。楊愛國等［2］采用距液氮表面 25、20、10 cm處各停留8 min的降溫方式對(duì)扇貝精子進(jìn)行超低溫保存，效果較好。李純等［3］用程序冷凍儀在超低溫保存櫛孔扇貝Chlamys farreri精子時(shí)發(fā)現(xiàn)，以20℃/min的降溫速率方式來保存精子，其效果最佳。史東杰等［4］以體積分?jǐn)?shù)為16%的DMSO為抗凍劑，采用五步降溫的方式冷凍保存缺簾魚Bryconcophalus精子并獲得成功。本試驗(yàn)中，作者采用分步降溫冷凍方式，通過查看液氮面上方不同高度間的溫度確定降溫方式［5］，在液氮面上方15 cm(約-60℃)和3 cm(約-160℃)處分別停留3 min和5 min后浸入液氮中，對(duì)精子的保存效果較好。楊培民等［6］在對(duì)蝦夷扇貝Patinopecten yessonesis進(jìn)行冷凍保存時(shí)也得出類似的結(jié)果。

3.2 冷凍保護(hù)液的篩選

在精液中加入冷凍保護(hù)液后，通過提高精子細(xì)胞質(zhì)的濃度、降低冰點(diǎn)等作用來降低對(duì)精子的冷凍損傷。目前常用的冷凍保護(hù)劑有DMSO和甘油。DMSO的滲透力強(qiáng)，親水性好，能快速滲透進(jìn)精子細(xì)胞內(nèi)，降低精子細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的濃度;而甘油可防止細(xì)胞脫水，并能保護(hù)精子蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。但兩者在濃度較高的情況下都會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生一定的毒害作用。陳東華［12］研究發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下，甘油對(duì)精子的損傷程度明顯低于DMSO，但隨著濃度的增加，DMSO對(duì)精子的損傷程度增強(qiáng)。Anchordoguy等［13］研究了用DMSO保存銳脊單肢蝦Sicyonia ingentis精子的效果，結(jié)果表明，用體積分?jǐn)?shù)為5%的DMSO效果較好。Liliana等［14］的研究表明，在凍存紅鮑Halioti rufescens精子時(shí)，采用體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油對(duì)精子的凍存效果要好于體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO。

此外，海藻糖作為一種無毒無害的非特異性保護(hù)劑，它的抗脫水、抗高滲保護(hù)以及抗冷凍保護(hù)作用已逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。Suzuki等［15］在常用的保護(hù)劑中加入海藻糖，當(dāng)濃度為5～100 mmol/L時(shí)，能大大提高冷藏解凍的牛卵母細(xì)胞的受精率。Beattie等［16］的研究結(jié)果表明，海藻糖對(duì)于長(zhǎng)期冷藏的人胰島器官有增強(qiáng)活力和保護(hù)的功能。Eroglu等［17］報(bào)道了冷凍保存時(shí)加入低濃度的海藻糖后，能大大提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存活率。

目前已有的研究中大多使用單一抗凍液，但單一冷凍保護(hù)劑各有優(yōu)缺點(diǎn)，不能滿足精子冷凍保存時(shí)對(duì)各方面條件的要求。若將各種冷凍保護(hù)液有機(jī)地結(jié)合起來，會(huì)達(dá)到較好的效果［18］。本試驗(yàn)中將DMSO(10%)、甘 油 (6%)、海 藻 糖 (25 mmol/L)混合組成冷凍保護(hù)液，結(jié)果表明，解凍后精子的存活率和受精率明顯提高，分別達(dá)到54.2%和29.0%。

3.3 平衡時(shí)間對(duì)精子凍存效果的影響

將添加了冷凍保護(hù)液的精液在低溫條件下平衡，是為了使?jié)B透型抗凍保護(hù)劑能充分滲入精子內(nèi)部，提高細(xì)胞內(nèi)的溶液濃度，降低冰點(diǎn)，減少胞內(nèi)結(jié)冰對(duì)細(xì)胞的損傷，提高保存材料對(duì)低溫的耐受能力［19］。但平衡時(shí)間過長(zhǎng)，則會(huì)對(duì)精子造成損傷，所以選擇合適的平衡時(shí)間，對(duì)于達(dá)到超低溫冷凍保存精子的效果是非常重要的。

不同物種精子的滲透能力不同，所需的平衡時(shí)間也不盡相同。Bougrier等［20］認(rèn)為，太平洋牡蠣Crassostrea gigas精子在冷凍保護(hù)液中的平衡時(shí)間不宜超過3 min，否則精子的受精率就會(huì)下降。Basavaraja等［21］的研究結(jié)果表明，解凍前平衡10～30 min對(duì)印度鲃Mahseer精子的凍存效果沒有影響。魯大椿等［22］認(rèn)為，對(duì)魚類精子低溫冷凍保存時(shí)，平衡時(shí)間應(yīng)為10～30 min。本研究結(jié)果表明，將中間球海膽精子與冷凍保護(hù)液混合后，當(dāng)平衡時(shí)間為15 min時(shí)，其冷凍效果較好。

3.4 添加葡萄糖對(duì)冷凍后精子受精率的影響

精子的受精率與精子的活力密切相關(guān)。要得到高的受精率，精子必須具有較強(qiáng)的活力［23］。有研究發(fā)現(xiàn)，外源性葡萄糖能被精子利用，增強(qiáng)精子的活力，延長(zhǎng)精子的壽命［23-25］。Urner等［26］研究表明，缺乏葡萄糖會(huì)阻礙小鼠精子進(jìn)入卵中，進(jìn)而影響精子與卵的融合。精子被激活后，由于精子運(yùn)動(dòng)和維持精細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡均需要消耗能量，這也是冷凍后精子受精率下降的原因之一。本研究中發(fā)現(xiàn):精子被解凍后在進(jìn)行受精時(shí)，在受精海水中添加適量的葡萄糖可以提高精子的受精率，葡萄糖濃度為56 mmol/L時(shí)其效果最好;但添加的葡萄糖濃度過高或過低時(shí)，都不利于精子受精。

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