賓承勇，王梅芳，豆偉，余祥勇

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524025)

馬氏珠母貝Pinctada martensii是培育海水珍珠的主要母貝，廣泛分布于中國廣東、廣西和海南沿海。多年來，各科研單位在馬氏珠母貝育苗養(yǎng)殖［1-3］、插核育珠［4-7］、良種選育［8-12］、病害防治等方面［13-15］已做了大量的研究。隨著苗種生產(chǎn)、遺傳育種、種質(zhì)保藏等研究的進一步發(fā)展，對貝類精子的質(zhì)量評價顯得越來越迫切和重要。目前，關(guān)于精子質(zhì)量評價主要集中在魚類及蟹類等方面［16-21］，而在貝類方面的研究還處于起步階段。精子形態(tài)是其質(zhì)量的一個重要表征，是評價精子功能最有價值的指標(biāo)之一，所以精子形態(tài)檢測是精子質(zhì)量評價的常規(guī)指標(biāo)之一。有關(guān)珠母貝精子的研究主要集中在精子的發(fā)生、超微結(jié)構(gòu)及冷凍保存方面［22-26］，有關(guān)精子質(zhì)量檢測方面的研究僅見喻達輝等［27］對精子活力的光鏡觀測，而有關(guān)精子的活體染色法與觀察檢測、形態(tài)分類及質(zhì)量評判等的研究尚未見報道。隨著染色方法的不斷改進，精子形態(tài)學(xué)分析備受關(guān)注。本研究中，作者就馬氏珠母貝的精子形態(tài)檢測進行研究，旨在找到一種簡單、有效、經(jīng)濟的染色方法來快速檢測貝類精子的形態(tài)，客觀、準(zhǔn)確地評價精子的功能狀態(tài)，為受精能力的預(yù)測、精子冷凍的研究等提供參考數(shù)據(jù)，這對于生產(chǎn)實踐具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用馬氏珠母貝于2009年11月取自湛江雷州，運回實驗室后洗凈暫養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 精子的獲得 挑選性腺發(fā)育成熟的鮮活雄貝，解剖后用吸管刺破性腺，吸取精液于50 mL小燒杯中，加入適量煮沸消毒過濾海水混勻。用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整精液濃度為3×106個/mL。

1.2.2 抹片制作 吸取適量樣品滴于干凈的載玻片邊側(cè)，另取一張載玻片，用其邊緣在滴加樣本載玻片表面拖拉精液制成涂片。

1.2.3 染色方法

1)曙紅Y染色

傳統(tǒng)法 用蒸餾水、煮沸消毒過濾海水分別配制20 mg/mL的曙紅Y母液，使用時根據(jù)需要稀釋到所需濃度。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，用蒸餾水及過濾海水配制曙紅Y染液時，染液濃度均為0.8 mg/mL。采用“1.2.2”節(jié)中的方法制作精子抹片，待抹片自然干燥后分別向精子抹片上滴加兩種染液進行染色，染色時間分別設(shè)置為8、30、60 min，棄去染液，自然干燥后觀察。

改良法 用過濾海水配制曙紅Y染液，染液濃度分別為0.8、5、10、15、20 mg/mL。將染液和精子樣品等體積混合后，立即制作抹片，待抹片自然干燥后觀察。

2)結(jié)晶紫染色

直接染色法 用煮沸消毒過濾海水配制20 mg/mL的母液，使用時根據(jù)需要稀釋到所需濃度。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置染液濃度為5 mg/mL，對抹片進行染色處理。向精子抹片上滴加適量染液，染色5 min后，棄去染液，自然干燥后觀察。

滲透染色法 吸取適量稀釋精液于載玻片上，用另一張載玻片或蓋玻片蓋于其上，沿邊緣滴加染液，在另一端用吸水紙吸取染料，使用滲透染色的方法使染料滲入且均勻分布，再拉開或揭開兩張玻片，得到兩張精子抹片，干燥后于顯微鏡下觀察。

3)精子形態(tài)分析

在顯微鏡下觀察 (40×10倍)，觀察數(shù)量為200個精子以上，參照文獻 ［28］中的方法，按下列標(biāo)準(zhǔn)對精子形態(tài)進行分類，并分別記錄其結(jié)果。

正常精子:頭部呈梨型，尾部與頭部成一條直線。采用嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)評估正常精子，頭、頸、中段和尾部都正常的精子才為正常精子。

頸折角型:頸部發(fā)生明顯彎曲，使頭部和尾部中段長軸不在一條直線上，之間的夾角大于90度。

彎尾型:尾部發(fā)生大角度彎曲，使頭部和尾部不在一條直線上。

圈尾型:尾尖卷曲形成小圓圈。

短尾型:尾部明顯短于正常精子尾部。

其它畸形有圓型，無頭，大頭，無尾，雙尾等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和單因素方差分析，用鄧肯氏 (Duncan)法進行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同染色方法的染色效果

2.1.1 曙紅Y染色法 將樣品抹片自然干燥后，經(jīng)0.8 mg/mL曙紅Y染色，不同染色時間下的染色效果見表1。用蒸餾水及煮沸消毒海水配制的曙紅Y染液均能使抹片上精子著色，但著色不完全(圖1-A、B)，即精子頸部、尾部皆可著色，而頭部僅頂體著色。即使染色時間延長至1 h，仍只有頭部的頂體著色，頭部輪廓形態(tài)不清。用海水配制的曙紅Y染液染色時，隨著染色時間的延長，精子的著色并未加深，反而背景雜質(zhì)染色加深且較多 (圖1-B)。故采用傳統(tǒng)的先抹片再染色的方法不能對精子的頭部進行形態(tài)特征的判別。

表1 精子用0.8 mg/mL的曙紅Y染液染色時不同染色時間下的染色效果Tab.1 The color pattern of sperm stained by 0.8 mg/mL Eosin Y under different time

考慮到用蒸餾水配置的染液與精子樣品混合后會降低樣品的滲透壓，因而影響精子的形態(tài)，故只使用海水配制曙紅Y染液。采用改良的染色方法時，即將樣品與用海水配制的不同濃度的曙紅Y染液等體積混合后，再進行抹片觀察，不同濃度染液的染色效果見圖1-C、D。采用0.8 mg/mL的曙紅Y染液 (即終濃度為0.4 mg/mL)染色時，可使精子略著紅色，但染色較淺，結(jié)構(gòu)模糊，觀察精子形態(tài)特征較困難，且背景雜亂，影響觀察效果;而采用20 mg/mL的曙紅Y染液染色后 (即終濃度為10 mg/mL)，精子頭部著深紅色，尾部著淺紅色，背景為淺粉紅色，對比明顯，精子各部分結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)特征明顯，背景干凈，易于觀察;當(dāng)使用的曙紅Y染液濃度為0.8～20 mg/mL時，精子的著色程度隨染液濃度的增大而加深，各部位結(jié)構(gòu)也漸漸清晰。當(dāng)曙紅Y染液濃度達20 mg/mL時，染色效果最為理想。故本研究中在進行形態(tài)觀察時，將精子樣品與20 mg/mL的曙紅Y染液等體積混合，采用先染色再抹片的改良方法進行染色處理。

2.1.2 結(jié)晶紫染色法 采用結(jié)晶紫染液染色時，處理方法不同，其染色效果也不同 (圖1-E、F)。

圖1 用曙紅Y、結(jié)晶紫染液染色后的精子染色特征以及正常、畸形 (頸折角型、彎尾型、圈尾型、短尾型)精子的形態(tài)特征 (40×10)Fig.1 Characterization of the sperms stained by Eosin Y and Crystal Violet，and characterization of normal sperm，abnormal sperm(curved neck，curved tail，coiled tail，and defect tail)(40 ×10)

圖1-E為制作精子抹片后直接滴加染液的染色效果。顯微鏡下觀察顯示，精子頭部、頸部、尾部皆著紫色，但頭部著色不完全，僅頭部頂體著色，不能對精子的頭部進行形態(tài)特征的判別。

圖1-F為采用滲透染色法的染色效果。該染色方法能使精子頭部著深紫色，尾部著淺紫色，背景顏色為淡粉紅色，對比明顯，各部分結(jié)構(gòu)清晰，染色特征明顯，可較準(zhǔn)確的對精子形態(tài)特征作出判斷。故本研究中在進行形態(tài)觀察時，用5 mg/mL的結(jié)晶紫染液對精子樣品采用滲透染色法進行染色處理。

2.2 精子的正常形態(tài)及各種畸形

經(jīng)曙紅Y(染液濃度20 mg/mL，改良法)和結(jié)晶紫 (染液濃度5 mg/mL，滲透染色法)染液染色后，依精子形態(tài)可將馬氏珠母貝精子分為兩大類:正常精子與畸形精子，其中畸形精子的主要類型為頸折角、彎尾、圈尾和短尾4種類型。馬氏珠母貝精子的畸形主要集中在精子的頸部和尾部，頭部畸形情況較少。各類型精子染色特征如圖1-G～P所示。

2.3 不同染色方法的效果比較

用曙紅Y、結(jié)晶紫染液染色后，對精子抹片的形態(tài)觀察統(tǒng)計結(jié)果見表2。從表2可見:采用兩種染液染色時觀察到的正常形態(tài)精子的比例無顯著差異 (P＞0.05);在畸形形態(tài)精子中，除用曙紅Y染色法時測得的頸折角型精子比例 (7.71%)顯著高于用結(jié)晶紫染色法的結(jié)果 (P＜0.05)外，在其它各類型的畸形精子率上，用兩種染液的染色結(jié)果并無顯著差異 (P＞0.05)。這說明兩種染色方法均適用于馬氏珠母貝精子的形態(tài)觀測上，其結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表2 不同染色方法對馬氏珠母貝精子形態(tài)的影響Tab.2 The morphology of the pearl oyster sperm stained by different methods

3 討論

3.1 精子形態(tài)的分類及評估標(biāo)準(zhǔn)

精子形態(tài)是否正常，是影響精子能否正常受精的重要因素［29］，而目前精子形態(tài)的分類在世界范圍內(nèi)還沒有建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。由于采用的染色方法和形態(tài)學(xué)評定標(biāo)準(zhǔn)不同，導(dǎo)致各試驗結(jié)果缺乏可比性［30］。傳統(tǒng)分類方法中將精子分為正常、無定型、錐型頭、大頭、小頭及未成熟型。但國內(nèi)采用的多為世界衛(wèi)生組織 (WHO)推薦的形態(tài)分類標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)主要將異常精子形態(tài)分為三大類，即頭部缺陷、頸/中段缺陷和尾部缺陷［28］。在進行形態(tài)計數(shù)時，只對帶尾部的且可辨認的精子進行精子計數(shù)，未成熟精子細胞包括圓形精子細胞階段，不能作為精子計數(shù)。精子頭脫落或無精子頭的不作為精子計數(shù)，精子頭脫落或無尾精子也不能作為頭部缺陷計數(shù)［31］。在較早的精子形態(tài)評估方案中，形態(tài)異常的精子有多種缺陷同時存在時，只記錄其中的一種，如頭部缺陷與中段缺陷同時存在時，只記錄頭部缺陷;中段缺陷與尾部缺陷同時存在時，優(yōu)先記錄中段缺陷?，F(xiàn)在常用的方法是，當(dāng)精子只有一處缺陷時，只記錄一處，若精子同時存在兩處或三處缺陷時，應(yīng)同時記錄兩處或三處［32］。本研究中，馬氏珠母貝精子形態(tài)的分類主要參考以上文獻及試驗過程中所觀察到的主要類型進行確定。分析表2數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，除彎尾型精子外，其它各類型精子率的浮動 (標(biāo)準(zhǔn)差)均較小，表明對馬氏珠母貝精子的形態(tài)分類結(jié)果穩(wěn)定可靠、客觀真實。在畸形精子中只有彎尾型精子的比例浮動最大，這從某種程度上暗示有人為因素的影響，可能是在制片干燥過程中，精子在載玻片上干燥后而不能保持原有形態(tài)造成的。同時，分類中參考的是對人類精子的分類標(biāo)準(zhǔn)，將此標(biāo)準(zhǔn)用于判斷馬氏珠母貝彎尾型精子，是否客觀有待商榷。

3.2 涂片對精子形態(tài)的影響

載玻片質(zhì)量對精子抹片效果有很大影響。試驗中用載玻片需在強酸洗液中浸泡48 h，用蒸餾水沖洗干凈，自然干燥后待用。未被強酸浸泡或浸泡時間不夠，涂片時會因玻片上有油漬，精液涂片后液體界面會立刻收縮，導(dǎo)致精液無法均勻附著在玻片上，且該片染色后背景雜質(zhì)多，嚴(yán)重影響觀察效果。

在馬氏珠母貝精子涂片的制備中，涂片經(jīng)曙紅Y染液染色后棄去染液觀察，玻片上明顯有濕感，顯微鏡下觀察，玻片上有大量的水滴，而精子的頭部淹沒于水滴中，僅能看到精子的尾部，同時背景雜質(zhì)也較多。將玻片置于酒精燈旁烘干后觀察，玻片上有大量的鹽的方形結(jié)晶顆粒。隨時間的延長可以觀察到鹽結(jié)晶顆粒吸水潮解，逐漸形成水滴。由于馬氏珠母貝為海產(chǎn)貝類，故在稀釋精液時使用了海水作為稀釋液，而海水中的鹽成分導(dǎo)致吸水現(xiàn)象的發(fā)生，且由于海水成分復(fù)雜，玻片上背景雜質(zhì)也頗多。為消除此現(xiàn)象，先后使用酒精、蒸餾水對涂片進行了脫鹽處理。用該方法雖然消除了鹽的影響，背景雜質(zhì)也大量減少，但同時也將染液沖洗掉了，使精子呈現(xiàn)無色狀態(tài)。傳統(tǒng)的濕片制備是將精液涂在載玻片上自然干燥，然后用乙醇固定，再行染色。用傳統(tǒng)方法制作馬氏珠母貝精子涂片經(jīng)染色后觀察發(fā)現(xiàn)，精子頸部、尾部皆著色，頭部僅頂體部位著色，不能對精子的頭部進行形態(tài)特征的判別。故用此方法制備的馬氏珠母貝精子涂片并不適用于形態(tài)觀察判別。為有效地消除涂片吸水及背景雜亂現(xiàn)象，本研究中對涂片的制作方法進行了改進，即先將染液和精液混合，再進行涂片。當(dāng)將曙紅Y染液濃度提高到20 mg/mL時，得到了清晰的精子涂片。

本研究中同時發(fā)現(xiàn)，不同的染料在使用方法上也存在差異。將曙紅Y染液的染色方法應(yīng)用到結(jié)晶紫染液上并不適合，而將結(jié)晶紫染液和馬氏珠母貝精液混合后涂片，顯微鏡下觀察到有大量精子聚集的現(xiàn)象，而使用壓片的方法卻能得到清晰的樣片。

3.3 染色方法的比較

本試驗中比較了曙紅Y、結(jié)晶紫兩種染色方法檢測形態(tài)正常精子率之間的差異。結(jié)果顯示，在精子形態(tài)學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)相同的情況下，兩種染色方法之間形態(tài)正常的精子比率并無顯著差異 (P＜0.05)。雖然采用曙紅Y染色法時測得的頸折角型精子的比率顯著高于用結(jié)晶紫染色方法的結(jié)果，但頸折角型精子所占精子總量的比例不足8%，對正常精子率與畸形精子率的總體判斷不會造成影響。這種差異可能是因不同染色方法顯現(xiàn)某種畸形精子的程度不一而造成的，類似的情況在人類精子形態(tài)檢測中也出現(xiàn)過。如高久春等［33］使用改良巴氏染色法、瑞-吉染色法和考馬斯亮藍染色法對人類形態(tài)正常精子率及頂體完整率進行了檢測。結(jié)果表明:用3種染色方法檢測的形態(tài)正常精子率兩兩比較，差異均不顯著;用瑞-吉染色法評價頸部和中段缺陷精子率及尾部缺陷精子率顯著低于用改良巴氏染色法和考馬斯亮藍染色法的比率。

本試驗中采用曙紅Y及結(jié)晶紫兩種染色方法時，判定的正常精子率間無顯著差異，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，表明這兩種染色方法均可用于馬氏珠母貝精子形態(tài)的檢測中，可以在生產(chǎn)實踐中推廣使用。

［1］金啟增.珍珠貝種苗生物學(xué)［M］.北京:海洋出版社，1992:20-23.

［2］陳兆和，周慶堂，何水養(yǎng)，等.馬氏珠母貝早春育苗，縮短母貝養(yǎng)成期試驗［J］.湛江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，1989，9(1-2):79-82.

［3］張志強.影響馬氏珠母貝人工育苗效果的原因淺析［J］.湛江海洋大學(xué)學(xué)報，1994，14(1):4-10.

［4］金啟增，黎輝，何慧.珍珠生長激素在合浦珠母貝育珠中的作用［J］.熱帶海洋，1998，17(4):44-50.

［5］李詠梅，王梅芳，李有寧，等.馬氏珠母貝育珠細胞小片和珠核處理技術(shù)研究:Ⅰ.不同處理液在海南陵水育珠的效果［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2010，30(4):11-16.

［6］王梅芳，余祥勇，李詠梅，等.馬氏珠母貝育珠細胞小片和珠核處理技術(shù)研究Ⅱ.不同處理液在廣東徐聞育珠試驗效果的比較［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2010，30(6):7-13.

［7］勞贊，鄧陳茂，梁盛.馬氏珠母貝術(shù)前處理的研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2003，22(4):27-29.

［8］張紅玉，何毛賢，管云雁.馬氏珠母貝紅色殼家系不同世代遺傳變異的 SRAP 分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2009，33(5):728-733.

［9］Deng Yuewen，Du Xiaodong，Wang Qingheng.Correlation and path analysis for growth traits in F1 population of pearl oyster Pinctada martensii［J］.Manre Science Bulletin，2008，10(2):68-73.

［10］王愛民，閻冰，葉力，等.馬氏珠母貝不同地理種群內(nèi)自繁和種群間雜交子一代主要性狀的比較［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2003，27(3):200-206.

［11］王梅芳，余祥勇，劉永.馬氏珠母貝雌雄同體和自體受精的研究［J］.水生生物學(xué)報，2006，30(4):420-424.

［12］王梅芳，余祥勇，劉永，等.馬氏珠母貝雜交與自繁后代及企鵝珍珠貝間同工酶差異分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2005，13(6):777-782.

［13］王愛民，石耀華，吳星.4種防治馬氏珠母貝多毛類寄生病方法的效果比較［J］.海洋水產(chǎn)研究，2004，25(2):41-45.

［14］李廣麗，杜曉東，葉富良.合浦珠母貝同工酶的電泳分析［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2001，8(2):17-22.

［15］王梅芳，余祥勇，劉永，等.2種珍珠貝的外套膜同工酶及粘液蛋白的電泳比較［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，23(5):555-559.

［16］季相山，陳松林，趙燕，等.魚類精子質(zhì)量評價研究進展［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2007，14(6):1048-1052.

［17］Liu Q H，Li J，Xiao Z Z，et al.Use of computer-assisted sperm analysis(CASA)to evaluate the quality of cryopreserved sperm in red seabream(Pagrus major)［J］.Aquaculture，2007，263(1-4):20-25.

［18］管衛(wèi)兵，王桂忠，李少菁.甲殼動物精子質(zhì)量和活力評價［J］.海洋通報，2003，22(2):83-88.

［19］管衛(wèi)兵，王桂忠，李少菁，等.鋸緣青蟹精子低溫冷藏及精子活力的染色法評價［J］.臺灣海峽，2002，21(4):457-462.

［20］孫菊香，范麗君，賈林芝，等.伊紅、PI染色法檢測中華絨螯蟹活精子率［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2007，31(9):69-72.

［21］馬強，丁銀娣，曲迪，等.伊紅、臺盼藍檢測河蟹精子存活率的比較［J］.動物學(xué)雜志，2007，42(4):65-69.

［22］沈亦平，馬麗君，張錫元，等.臺浦珠母貝的配子發(fā)生［J］.動物學(xué)報，1992，38(2):113-116.

［23］沈亦平，張錫元.合浦珠母貝精子發(fā)生過程的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.武漢大學(xué)學(xué)報，1993(6):123-127.

［24］杜曉東.三種珍珠貝精子發(fā)生及其超微結(jié)構(gòu)的比較研究［J］.湛江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，1996，16(2):1-6.

［25］余祥勇，王梅芳，陳鋼榮，等.馬氏珠母貝精子低溫保存主要影響因素的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，26(3):96-99.

［26］王梅芳，余祥勇，劉永，等.馬氏珠母貝精子的超低溫保存［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2006，30(2):170-174.

［27］喻達輝，陳競春，蘇天鳳，等.合浦珠母貝精子的實驗生物學(xué)初步研究［J］.熱帶海洋，1998，17(1):83-86.

［28］世界衛(wèi)生組織.世界衛(wèi)生組織人類精液精子——宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊［M］.4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:9-15.

［29］Coetzee K，De Villiers A，Thinus F K，et al.Clinical value of using an automated sperm morphology analyzer［J］.Fertility and Sterility，1999，71(2):222-225.

［30］Zinaman M J，Brown C C，Selevan S G，et al.Semen quality and human fertility:a prospective study with healthy couples［J］.Journal of Andrology，2000，21(1):145-153.

［31］王書佳，李慕軍.精子形態(tài)學(xué)在男性不育中的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(10):1540-1542.

［32］沙艷偉.精子形態(tài)相關(guān)因素分析［D］.長春:吉林大學(xué)，2005:44.

［33］高久春，王瑞雪，許宗革，等.精子形態(tài)學(xué)分析中染色方法的比較［J］.吉林大學(xué)學(xué)報，2005，31(5):778-780.