李博，蔡恒江、2，劉長(zhǎng)發(fā)、2

(1.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧大連116023;2.遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

赤潮是全球性的海洋生態(tài)災(zāi)害。20世紀(jì)以來，隨著海洋污染和富營(yíng)養(yǎng)化的日趨加重，世界各地沿海赤潮頻繁爆發(fā)，且引發(fā)赤潮的微藻種類越來越多，赤潮影響的區(qū)域面積也越來越大，尤其在亞洲赤潮頻發(fā)現(xiàn)象更為嚴(yán)重［1］。由于赤潮生消過程及其物理、化學(xué)和生態(tài)學(xué)過程相互作用的復(fù)雜性，目前還沒有非常理想的治理方法。利用海洋環(huán)境中的生物因子進(jìn)行赤潮的防控已引起人們的重視［2-3］，其中利用大型海藻與微藻間的相互作用來預(yù)防或控制赤潮是一個(gè)新的研究方向［4］。

在水域生態(tài)系統(tǒng)中，大型海藻和微藻之間存在著“拮抗”關(guān)系［5-7］。大型海藻與海洋微藻同處于海洋生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)者的地位，生態(tài)位高度重疊，與微藻競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、光照和生長(zhǎng)空間等。大型海藻不僅能夠凈化水質(zhì)，還能與赤潮微藻進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，防止赤潮微藻的爆發(fā)性繁殖與增長(zhǎng)［8］。當(dāng)光照和營(yíng)養(yǎng)鹽充足時(shí)，大型海藻對(duì)浮游藻類有明顯的生化抑制效應(yīng)，大型海藻能夠向環(huán)境中釋放相生相克類化合物，抑制赤潮微藻的生長(zhǎng)［9-10］。

本研究中，作者采用室內(nèi)模擬試驗(yàn)方法，研究了角叉菜對(duì)兩種赤潮微藻的克生作用，以期為赤潮防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

米氏凱倫藻Karenia mikimotoi和微小原甲藻Prorocentrum minimum由中國(guó)海洋大學(xué)微藻培養(yǎng)中心提供，兩種藻均屬赤潮藻種。

大型海藻角叉菜Chondrus ocellatus采集于大連市黑石礁海域，將角叉菜表面的雜藻去除，用蒸餾水洗去泥沙及其它附著物，再用滅菌海水漂洗3～4次，預(yù)培養(yǎng)于f/2培養(yǎng)液中［11］。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法和條件 天然海水采自大連市黑石礁海域，經(jīng)過脫脂棉過濾、滅菌，冷卻至室溫，用玻璃纖維素膜 (0.45 μm孔徑)過濾除去顆粒物質(zhì)，將pH和鹽度分別調(diào)至8.5和30。培養(yǎng)液采用f/2營(yíng)養(yǎng)鹽配方，培養(yǎng)溫度為 (20±1)℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光暗周期為12 h∶12 h。用于微藻培養(yǎng)的300 mL三角瓶預(yù)先用1 mol/L的鹽酸浸泡24 h，用滅菌海水沖洗干凈后待用。

以下所有試驗(yàn)中，每個(gè)三角瓶中均加入150 mL f/2培養(yǎng)液，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組。試驗(yàn)共進(jìn)行12 d，每天從培養(yǎng)瓶中定時(shí)采樣1 mL，觀察微藻細(xì)胞密度的變化。取樣后每個(gè)培養(yǎng)瓶中再加入f/2營(yíng)養(yǎng)鹽，以彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽的不足［12］。

1.2.2 新鮮角叉菜對(duì)兩種有害赤潮微藻的作用試驗(yàn) 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的米氏凱倫藻和微小原甲藻分別與不同含量的新鮮角叉菜共同培養(yǎng)于300 mL三角燒瓶中，兩種微藻的起始密度均為1×104個(gè)/mL，每個(gè)瓶中新鮮角叉菜的含量分別設(shè)置為0(對(duì)照)、0.333、0.667、1.333、2.667 g/L。

1.2.3 角叉菜干粉末對(duì)兩種有害赤潮微藻的作用試驗(yàn) 將新鮮的角叉菜在室溫下完全干燥7 d，然后用研缽研磨成粉末。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的米氏凱倫藻和微小原甲藻分別與不同含量的角叉菜干粉末共同培養(yǎng)于300 mL三角燒瓶中，兩種微藻的起始密度均為1×104個(gè)/mL，每個(gè)瓶中角叉菜干粉末的初始含量分別設(shè)置為0(對(duì)照)、0.167、0.333、0.667、1.333 g/L。

1.2.4 不同濃度的角叉菜水溶性抽提液對(duì)兩種有害赤潮微藻的作用試驗(yàn) 取新鮮角叉菜10 g，加入少許蒸餾水研磨成漿，以3 000 r/min離心15 min。取上清液，用海水定容至50 mL，以此液為母液，用海水將其分別稀釋為系列梯度濃度:0(對(duì)照)、0.667、1.333、2.667、5.333 g/L，將兩種有害赤潮微藻立即分別接種于不同濃度梯度的水溶性抽提液中。

1.2.5 角叉菜培養(yǎng)水過濾液對(duì)兩種有害赤潮微藻的作用試驗(yàn)

1)一次性培養(yǎng) 在每升f/2培養(yǎng)液中加入80 g/L的新鮮角叉菜，培養(yǎng)7 d后，移去新鮮角叉菜，將培養(yǎng)液經(jīng)玻璃纖維素濾膜 (0.22 μm)過濾，以消除濾液中的細(xì)菌。將兩種有害赤潮微藻立即分別接種于上述培養(yǎng)角叉菜的過濾液中，并適量添加f/2培養(yǎng)液。以在過濾的f/2培養(yǎng)液中培養(yǎng)兩種有害赤潮微藻作為對(duì)照。

2)半連續(xù)培養(yǎng) 按照上述方法將兩種有害赤潮微藻分別接種于角叉菜培養(yǎng)液的過濾液中，每天將每個(gè)培養(yǎng)瓶中的150 mL培養(yǎng)液移出30 mL，再重新加入30 mL角叉菜培養(yǎng)液的過濾液，對(duì)照組每天續(xù)加30 mL f/2培養(yǎng)液。

1.2.6 微藻細(xì)胞密度的測(cè)定 微藻用Lugol碘液固定，采用平板計(jì)數(shù)法，在Olympus雙筒顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 新鮮角叉菜對(duì)兩種有害赤潮微藻的作用

從圖1可見，新鮮角叉菜對(duì)米氏凱倫藻和微小原甲藻的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且隨著新鮮角叉菜含量的增加，抑制作用愈加明顯。當(dāng)新鮮角叉菜含量為2.667 g/L時(shí)，微小原甲藻細(xì)胞在第8天被完全殺滅;而米氏凱倫藻在試驗(yàn)過程中并未完全被殺滅。

圖1 與新鮮角叉菜共培養(yǎng)時(shí)米氏凱倫藻、微小原甲藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of K.mikimotoi，and P.minimum coexistence with fresh tissues of C.ocellatus

2.2 角叉菜干粉末對(duì)兩種有害赤潮微藻的作用

從圖2可見，角叉菜干粉末對(duì)米氏凱倫藻和微小原甲藻的生長(zhǎng)也有明顯的抑制作用。當(dāng)角叉菜干粉末濃度為0.667、1.333 g/L時(shí)，米氏凱倫藻第4天全部死亡;當(dāng)角叉菜干粉末濃度為1.333 g/L時(shí)，微小原甲藻細(xì)胞第2天就全部死亡，角叉菜干粉末濃度為0.333、0.667 g/L時(shí)，微小原甲藻細(xì)胞在第4天全部死亡。

圖2 與角叉菜干粉末共培養(yǎng)時(shí)米氏凱倫藻、微小原甲藻的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of K.mikimotoi，and P.minimum coexistence with dry powder of C.ocellatus

2.3 角叉菜水溶性抽提液對(duì)兩種有害赤潮微藻的作用

從圖3可見:較高濃度的角叉菜水溶性抽提液對(duì)米氏凱倫藻和微小原甲藻的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，其中米氏凱倫藻的生長(zhǎng)受到了明顯的影響，且抑制作用隨角叉菜水溶性抽提液濃度的升高而加強(qiáng);較低濃度的角叉菜水溶性抽提液 (0.667、1.333 g/L)對(duì)微小原甲藻的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，較高濃度的角叉菜水溶性抽提液 (2.667、5.333 g/L)則能明顯地抑制該藻的生長(zhǎng)。

圖3 與角叉菜水溶性抽提液共培養(yǎng)時(shí)米氏凱倫藻、微小原甲藻的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of K.mikimotoi，and P.minimum coexistence with aqueous extracts of C.ocellatus

2.4 一次性和半連續(xù)添加角叉菜培養(yǎng)水過濾液對(duì)兩種赤潮微藻的作用

圖4為角叉菜培養(yǎng)水過濾液在一次性和半連續(xù)添加方式下對(duì)米氏凱倫藻和微小原甲藻的作用結(jié)果。從圖4可見:在一次性添加方式下，角叉菜的培養(yǎng)水過濾液對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)沒有顯著的抑制作用 (P＞0.05)，但在半連續(xù)添加方式下，米氏凱倫藻的生長(zhǎng)受到了顯著抑制 (P＜0.05);而對(duì)于微小原甲藻，無論在一次性還是在半連續(xù)添加方式下，角叉菜培養(yǎng)水過濾液對(duì)該藻的生長(zhǎng)都有顯著的抑制作用 (P＜0.05)。

3 討論

3.1 角叉菜克生赤潮微藻生長(zhǎng)的可能機(jī)制

植物間的相生相克作用是指一種植物通過向環(huán)境中分泌化合物而影響其它生物生長(zhǎng)的現(xiàn)象［13］。Hogetsu等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，大型海藻分泌的相生相克類化合物能夠抑制其它藻類的生長(zhǎng)，并首次提出利用大型海藻的克生作用來控制微藻生長(zhǎng)的觀點(diǎn);Keating［15］的研究證明，相生相克類化合物能夠明顯抑制浮游植物的演替;Jin等［10］的研究認(rèn)為，石莼分泌的一些相生相克類化合物能抑制共培養(yǎng)體系中赤潮異彎藻和塔瑪亞歷山大藻的生長(zhǎng)。另一方面，大型海藻能夠通過對(duì)周圍環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)性吸收來抑制其它藻類的生長(zhǎng)［8］。本試驗(yàn)中每天都補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)鹽，以彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽不足帶來的影響。

圖4 在一次性和半連續(xù)角叉菜培養(yǎng)水過濾液添加方式下米氏凱倫藻、微小原甲藻的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of K.mikimotoi，and P.minimum under initial or semi-continuous culture medifiltrate supplemented with C.ocellatus

角叉菜的新鮮組織和干粉末對(duì)米氏凱倫藻和微小原甲藻的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，在較高的濃度下還能完全殺死藻細(xì)胞。Nakai等［2］的研究發(fā)現(xiàn)，大型海藻Myriophyllum spicatum能夠持續(xù)向環(huán)境中分泌一種不穩(wěn)定的、對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)具有抑制作用的相生相克類化合物。本試驗(yàn)結(jié)果表明，角叉菜水溶性抽提液對(duì)兩種赤潮微藻的生長(zhǎng)皆有抑制作用，且抑制作用隨角叉菜濃度的升高而加強(qiáng)。這表明角叉菜組織中具有抑制赤潮微藻生長(zhǎng)的克生物質(zhì)，進(jìn)一步證明克生物質(zhì)的存在是角叉菜對(duì)赤潮微藻產(chǎn)生克生效應(yīng)的主要方式之一。角叉菜培養(yǎng)水過濾液在一次性培養(yǎng)方式下對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)沒有顯著影響，而在半連續(xù)培養(yǎng)方式下有顯著的影響，可以推斷角叉菜分泌了非常容易降解的克生物質(zhì)，并且大型海藻活體組織里克生物質(zhì)的連續(xù)分泌是有效抑制赤潮微藻生長(zhǎng)的關(guān)鍵。另外，Gross等［4］的研究認(rèn)為，相生相克類化合物是通過細(xì)胞間的直接接觸傳遞至目標(biāo)生物的，而本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果不同。因?yàn)榻遣娌四軌蛑苯訉⑾嗌嗫祟惢衔锓置诘街車h(huán)境中，因此，角叉菜對(duì)赤潮微藻產(chǎn)生的克生作用并不是通過細(xì)胞間的直接接觸實(shí)現(xiàn)的。

3.2 角叉菜在赤潮防治中的作用

大型海藻能夠產(chǎn)生或向周圍環(huán)境中分泌化學(xué)物質(zhì)，從而抑制環(huán)境中浮游生物的生長(zhǎng)，它是海藻的一種有效的防御機(jī)制，能夠確保其在與其它光合作用植物的競(jìng)爭(zhēng)中保持優(yōu)勢(shì)。如Gross等［4］曾經(jīng)報(bào)道，大型海藻能夠向周圍水體中分泌多酚類物質(zhì)，這種物質(zhì)能強(qiáng)烈抑制水體中藍(lán)細(xì)菌的生長(zhǎng);Van等［16］的研究表明，Ceratophyllum demersum通過分泌相生相克類化合物來抑制水體中一些附生植物和浮游植物的生長(zhǎng);Jasser［17］研究發(fā)現(xiàn)，C.demersum能夠分泌相對(duì)分子質(zhì)量為3 000左右的化合物，這種化合物能夠抑制水體中藍(lán)細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而改變了水體中浮游植物的優(yōu)勢(shì)種群結(jié)構(gòu);Jeong等［9］的研究結(jié)果也表明，海藻Corallina pilulifera可以通過分泌相生相克類化合物殺滅共培養(yǎng)體系中的赤潮微藻;孔石莼所分泌的相生相克類化合物同樣能明顯抑制與之共培養(yǎng)的8種微藻［18］。這些研究都表明，大型海藻可能是一種潛在的生物調(diào)控因子，它能在赤潮的防控中發(fā)揮重要作用。

角叉菜分泌或產(chǎn)生的相生相克類化合物能夠影響或殺滅共培養(yǎng)體系中的赤潮微藻，這種特性使得其可能在赤潮的調(diào)控方面具有重要作用。但是，角叉菜是一種潮間帶生物，而赤潮一般發(fā)生在遠(yuǎn)離海岸帶的地方，因此角叉菜不能被直接引入到特定水域中進(jìn)行赤潮的防控。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，角叉菜所分泌或產(chǎn)生的活性物質(zhì)同樣具有殺藻作用，因此，可以將提取、純化后的活性物質(zhì)用于殺滅赤潮微藻，但其用量或潛在的生態(tài)效應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。

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