何 偉，陳財發(fā)，姚 毅，朱 文，楊澤麗，白 麗*

（1.大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理學院公共衛(wèi)生學院，云南大理 671000）

念珠菌屬條件致病性酵母樣真菌，常寄生于人體與外界相通的腔道中，如口腔、腸道、陰道等，健康人群攜帶率較低（口腔中約9%）〔1〕。由各種原因（如HIV感染，抗生素的濫用等）導致機體抵抗力下降、菌群失調或寄生位置發(fā)生改變所致的真菌機會性感染呈日益增多的趨勢，其中主要是念珠菌病〔2-3〕。隨著抗真菌藥物在黏膜念珠菌病中的廣泛使用，念珠菌的敏感性逐漸降低，耐藥株呈現(xiàn)增加趨勢?？拐婢幬锩舾行缘难芯孔兊糜葹橹匾?。本文采用美國臨床和實驗室標準化研究所（The Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的M27-A2方案，即微量液基稀釋法，通過對分離自大理地區(qū)健康女性陰道念珠菌的藥物敏感性的分析，為臨床抗真菌藥物的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 分離自大理健康人群陰道念珠菌45株。 經(jīng)過鑒定〔4〕，包括29株光滑念珠菌（Candida glabrata），11株白色念珠菌 （ Candida albicans），4株克柔念珠菌（Candida krusei），1株熱帶念珠菌（ Candida tropicalis） 。

1.2 標準菌株 ATCC10029（大理學院病原生物學綜合實驗室保存）作為4種藥物的敏感性標準株。

1.3 RPMI-1640液的配制 取10.4 g RPMI-1640粉（含L谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉，GIBCO）溶于900 mL無菌水中，加入34.53 g三氮嗎啡啉丙磺酸（MOPS，夏斯生物）至其終濃度為0.165 mol/L，室溫下用磁力攪拌器混勻2～3 h，使其充分溶解，用1 mol/L NaOH調pH至7.0（25℃），用滅菌雙蒸水定容至1 L，濾過除菌，備用。

1.4 抗真菌藥物

1.4.1 儲存液 儲存液的濃度為應用液10倍，5-氟胞嘧啶（Fluorocytosine，5-FC）和氟康唑（Fluconazole，F(xiàn)CZ） 為1280 μg/mL， 兩性霉素B（ AmphotericinB，AMB） 和酮康唑（ Ketoconazole，KCZ） 為320 μg/mL，分裝于-70℃保存?zhèn)溆谩?種藥物均來源于中國藥品生物制品檢定所。

1.4.2 應用液的制備 用RPMI-1640液將儲存液作1∶10稀釋，F(xiàn)CZ和5-FC為128～0.25 μg/mL10個系列濃度，AMB和KCZ為32～0.06 μg/mL10個系列濃度，均為兩倍終濃度。

1.4.3 微量藥敏培養(yǎng)板的制備 使用96孔平底微量培養(yǎng)板，1～10列分別加入系列濃度梯度的抗真菌藥物的應用液，從高濃度到低濃度，11列及12列加入RPMI-1640液（作為生長對照及空白對照），每孔100 μL，放入-20℃冰箱備用，使用時需經(jīng)4℃和室溫各1 h。

1.5 藥敏試驗

1.5.1 念珠菌的激活與稀釋 將待測菌株在YPD（ 1%yeast extract，1%peptone，2%dextrose） 瓊脂培養(yǎng)基上兩次激活后，用生理鹽水配制菌懸液，取少許，在血細胞計數(shù)板上計數(shù)，用RPMI-1640液調整濃度為3×103CFU/mL（ 2倍終濃度）。

1.5.2 加樣 在上述制備好的含抗真菌藥物的培養(yǎng)板上加入念珠菌懸液，每孔100 μL，空白對照不加，振蕩混勻后放入濕盒中，35℃孵育48 h后觀察結果。

1.5.3 結果判斷 肉眼判斷結果，以生長對照孔為依據(jù)，AMB為完全抑制即MIC 100作為觀察終點，液體清亮；其余3種藥以80%抑制作為觀察終點，即MIC 80為觀察終點，菌體生長明顯減少，液體輕微渾濁；同時陽性生長對照孔中生長良好，空白對照清亮，無菌生長，質控菌株MIC值在CLSI推薦的M27-A2方案規(guī)定的范圍內，才能判斷實驗的有效性。質控菌株對抗真菌藥物的MIC值符合CLSI推薦的M27-A2方案關于質控菌株標準的要求〔5〕。

1.6 四種常用抗真菌藥物敏感性判斷標準 根據(jù)菌株的MIC值范圍，參照文獻〔1，6〕，判斷念珠菌的敏感程度，分為敏感（susceptible，S）、劑量依賴性敏感（ susceptible dose-dependent，SDD）、和耐藥（ resistant，R） 3種。 見表1。

表1 抗真菌藥物敏感性判斷標準（MIC）（μg/mL）

2 實驗結果

2.1 陰道念珠菌分離株對四種藥物敏感性 45株健康人群陰道念珠菌對抗真菌藥物FCZ、KCZ、5-FC、AMB的耐藥率分別為：8.89%、6.67%、6.67%、2.22%，敏感率分別為：80%、84.44%、91.11%、97.78%，見表2。

表2 45株陰道念珠菌對四種抗真菌劑的藥物敏感性n（%）

比較4種抗真菌藥物的耐藥率，經(jīng)卡方檢驗χ2=1.829，P=0.609，4種藥物的耐藥率差異無統(tǒng)計學意義。比較4種抗真菌藥物的敏感率，經(jīng)卡方檢驗χ2=7.881，P=0.049，4種藥物的敏感率差異有統(tǒng)計學意義；經(jīng)秩和兩兩檢驗，45株念珠菌對4種抗真菌藥物的敏感率除AMB的藥物敏感性比FCZ好（P=0.008），AMB的藥物敏感性比KCZ的好（P=0.027）外，其余藥物的敏感率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 交叉耐藥情況及其MIC值 結果顯示1株克柔念珠菌（425） 同時對FCZ、KCZ和5-FC三種藥物耐藥，另一株克柔念珠菌（460）對KCZ和5-FC同時耐藥，說明存在交叉耐藥現(xiàn)象，且都是克柔念珠菌。見表3。

表3 8株耐藥念珠菌對抗真菌藥物的MIC值（ μg/mL）

3 討論

近年來，念珠菌的感染率逐漸升高，臨床選擇敏感的抗真菌藥物治療感染顯得越來越重要〔7〕。本研究調查了分離自大理地區(qū)健康女性陰道45株念珠菌對臨床常用的四種抗真菌劑的敏感性，結果顯示分離株對AMB的藥物敏感率最高（97.78%），F(xiàn)CZ的藥物敏感率最低（80%）；藥物敏感率除AMB的藥物敏感性比FCZ好（P=0.008），AMB的藥物敏感性比KCZ的好（P=0.027）外，其余藥物的敏感率差異無統(tǒng)計學意義（ P＞0.05），這與郭利軍〔8〕等報道的AMB敏感性最好相符。藥物的耐藥率差異無顯著性，與之前近年國內周訊〔9〕等報道比較的相比，念珠菌對FCZ、KCZ和5-FC耐藥率相似，對AMB耐藥率相差較大，這可能與近年來臨床上和個人常用抗真菌藥物為唑類有關。提示今后念珠菌的感染在用藥上應注意聯(lián)合用藥，在唑類藥物效果不明顯時考慮應用兩性霉素。45株念珠菌中有2株同時耐受多種抗真菌藥物，且都為克柔念珠菌，此交叉耐藥現(xiàn)象與Rex〔10〕等報道的相似，這提示臨床用藥要注意耐藥株的存在，特別是具有交叉耐藥性的克柔念珠菌。綜上所述，4種臨床常用抗真菌藥物均可選作陰道念珠菌病的治療，但相比而言，更推薦使用AMB，同時應注意某些菌株的劑量依賴性敏感、耐藥及交叉耐藥現(xiàn)象，尤其是克柔念珠菌。

〔1〕武有聰，陳兆芳，劉奇，等.HIV感染者與健康人群口腔念珠菌的體外藥物敏感性比較〔J〕.中國人獸共患病學報，2009，25（ 9）：878-881，849.

〔2〕Lu JJ，Lee SY， Chiueh T S.In vitro antifungal susceptibility testing of Candida blood isolates and evaluation of the E-test method〔J〕.J Microbiol Immunol Infect， 2004， 37（ 6）：335-342.

〔3〕袁有華，白麗，武有聰，等.吸毒人群口腔假絲酵母藥物敏感性分析〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2011，27（ 9）：1137-1139.

〔4〕白麗，申元英，王晶，等.健康人群口腔念珠菌的分離及菌種分布〔J〕.中國微生態(tài)學雜志，2005，17（ 2）：33-34.

〔5〕National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts.Approved standard，2nd ed.M27-A2.Wayne， Pa： National Committee for Clinical Laboratory Standards〔S〕.2002.

〔6〕王端禮.醫(yī)學真菌學實驗室檢驗指南〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：103-110.

〔7〕Córdoba S，Vivot W，Bosco-Borgeat ME，et al.Species distribution and susceptibility profile of yeasts isolated from blood cultures：results of a multicenter active laboratory-based surveillance study in Argentina〔J〕.Rev Argent Microbiol，2011，43（ 3）：176-185.

〔8〕郭立軍，白麗，王晶，等.男性STD病人治療后泌尿道念珠菌感染情況及敏感分析〔J〕.中國皮膚性病學雜志，2009，23（ 1） ：36-38.

〔9〕周訊，李桂明.110株念珠菌的菌種鑒定及藥敏試驗〔J〕.重慶醫(yī)科大學學報，2007，32（ 4）：425-427.

〔10〕Rex JH，Rinaldi MG，Pfaller MA，et al.Resistance of Candida Species to fluconazole〔J〕.Antimicrob Agents Chemother， 1995，39（ 1） ：1-8.