張海珠，馬 媛，周 萍

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

泡核桃（Juglans sigillata）又名漾濞核桃、茶核桃、鐵核桃，系胡桃科（ Juglandaceae）胡桃屬（ Juglans）植物。種植較廣泛，主要分布于云南〔1〕、貴州、四川西部等，生長于海拔1300～3300 m山坡或山谷林中〔2〕。核桃取仁后的副產(chǎn)物即為核桃殼，其質地堅硬，常被作為廢物棄掉或焚燒，造成了資源的極大浪費，其利用價值極低。為使這一生物資源得到有效利用，學者們從多方面對它的應用價值進行研究，取得了一定成果，如制造活性炭〔3-5〕、作為新能源燃料〔6〕、制造眼鏡、手表等零件的清洗和拋光材料〔7〕、作為濾料、堵漏材料、有機稀釋肥、抗聚劑〔8〕、催化熱解制取氫氣〔9〕、制備木材膠粘劑〔10〕、制造顆粒填充聚氯乙烯基復合材料可改善材料的隔聲性能〔11〕等應用。并發(fā)現(xiàn)核桃殼具有一定的藥理作用，如提取物對心肌缺血有保護作用〔12〕、木醋液有抑菌作用〔13〕等。本實驗對核桃殼的提取物HTKD、HTKE、HTKF對常見致病菌的抑制作用進行了初步實驗，并測定了它們的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以期進一步開發(fā)核桃殼的藥用價值，拓展其應用前景。

1 實驗儀器與試藥

1.1 實驗儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），電熱恒溫培養(yǎng)箱（蕭山永發(fā)電器有限公司滬南實驗儀器廠），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司、上海-恒科學儀器有限公司），SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 實驗試藥 MH（A）培養(yǎng)基、MH（B）、沙氏瓊脂培養(yǎng)基、液體沙氏瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂粉等均由北京奧博星生物技術有限責任公司提供。綠膿桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、白色念珠菌均由大理學院基礎醫(yī)學院病原微生物教研室提供。泡核桃采集自云南省大理州漾濞縣，由大理學院生藥學教研室周濃副教授鑒定為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）植物泡核桃（ Juglans sigillata）。

2 實驗方法

2.1 泡核桃提取物原液的配制 泡核桃殼經(jīng)10%NaOH浸泡24 h后，用冰醋酸調pH為中性，加2、4、6倍乙醇沉淀得到HTKD、HTKE、HTKF提取物。精密稱取HTKD、HTKE、HTKF組分，用蒸餾水溶解，配制成濃度為250 mg/mL、333.3 mg/mL、200 mg/mL的藥物原液，滅菌后備用。

2.2 供試菌混懸液的制備 將6種細菌菌落（遵循少量多次的原則）置于約2 mL生理鹽水中，混勻，與0.5麥氏比濁管比對，相同后用液體肉湯/沙氏培養(yǎng)基稀釋3次，使含菌量約為0.5×106CFU/mL，作為供試菌混懸液。

2.3 核桃殼提取物MIC和MBC的測定〔14〕

2.3.1 MIC的測定 將三種組分藥物原液用試管稀釋法進行倍比稀釋為10管，過濾后，按濃度從低到高的順序依次吸取100 μL加入到96孔板的相應孔中，再向此些孔中加入100 μL菌液（濃度為0.5×106CFU/mL），置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h〔15〕。 板中可用肉眼觀察到有渾濁的孔表示有細菌生長，每行最后一個澄清的孔中的藥物稀釋濃度即為該藥物的MIC。

2.3.2 MBC的測定 取MIC測定中無細菌生長孔中的混合液各100 μL注入瓊脂培養(yǎng)基，用涂布法展開，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以菌落數(shù)不超過5個的平板所對應的小試管的最低藥物濃度為該藥物的最低殺菌濃度（MBC）。

2.4 對照實驗 空白對照：200 μL液體培養(yǎng)基，藥液和菌液均不加；陰性對照：液體培養(yǎng)基100 μL加稀釋后最小濃度的藥液100 μL，不加菌液；陽性對照：液體培養(yǎng)基100 μL，加相應的菌液100 μL，不加藥液。

3 結果

3.1 核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分的抗菌實驗結果 （ 表1～3）

表1 核桃殼HTKD組分的抗菌實驗結果

表2 核桃殼HTKE組分的抗菌實驗結果

表3 核桃殼HTKF組分的抗菌實驗結果

3.2 核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分的MIC及MBC （表4～5）

表4 核桃殼提取物對8種細菌的MIC

表5 核桃殼提取物對8種細菌的MBC

4 討論

本實驗采用微量稀釋法進行泡核桃殼提取物HTKD、HTKE、HTKF組分進行MIC、MBC的測定，對了解泡核桃殼提取物有無抗菌作用、抗菌效果如何、確定用藥劑量和研究抗菌機理等方面具有重要意義。實驗結果表明泡核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分對綠膿桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、白色念珠菌等8種臨床常見致病菌均有一定的抑制或殺滅作用。雖然此實驗呈現(xiàn)了一定的結果，但是體外抗菌實驗的環(huán)境與體內不同，所以這些提取物還需要進一步通過動物體內實驗來證明其抗菌作用，進而為開發(fā)核桃殼的抗菌藥用價值奠定基礎。

近年來，不合理使用抗生素導致耐藥菌逐漸增多，這些細菌的感染嚴重威脅人類的健康。但細菌較少對抗菌中藥產(chǎn)生耐藥，研究和開發(fā)抗菌中藥對解決耐藥細菌的產(chǎn)生具有重要意義〔16〕。本實驗研究的泡核桃殼具有來源廣泛、費用低等優(yōu)點，對其進行抗菌成分及機理的研究，通過建立動物模型，設定客觀的評價標準，為其今后在臨床應用提供科學依據(jù)。

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