閻旭一，劉云春

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

保護(hù)海洋資源，充分利用已得到的資源，是有志者的共識(shí)和責(zé)任。扇貝貝殼是水產(chǎn)廢棄物，扇貝貝殼含有的成分95%以上是碳酸鈣，有機(jī)成分不足5%，在日本和其他歐美國(guó)家多作為墻壁涂料、土壤改良劑來(lái)加以利用。扇貝貝殼和珍珠的形成機(jī)制相似。在我國(guó)珍珠粉作為美容原料及中藥成分使用廣泛，價(jià)格不菲。為提高扇貝貝殼有效利用的附加值，我們對(duì)扇貝貝殼成分進(jìn)行了較為詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)研究。扇貝貝殼的抽出成分含有數(shù)種生物活性成分已被前期實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)〔1〕。我們使用扇貝貝殼所含的生物活性物質(zhì)對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的影響進(jìn)行了體外作用評(píng)價(jià)；使用對(duì)脂肪分解有促進(jìn)作用的異丙腎上腺素，作為扇貝貝殼所含生物活性物質(zhì)有無(wú)促進(jìn)脂肪分解作用的對(duì)比；使用珍珠所含生物活性物質(zhì)進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，來(lái)明確脂肪分解作用是否為扇貝貝殼所特有。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 扇貝貝殼甲醇抽出成分的提取 取200 g扇貝貝殼粉碎后，裝入透析袋（MD25），在5%的醋酸溶液中進(jìn)行透析，溶解除去扇貝貝殼中的碳酸鈣；再用脫離子水透析，除去醋酸；除去醋酸的扇貝貝殼成分進(jìn)行濃縮干燥后，加入70%甲醇溶解離心，取上清液濃縮干燥，得到扇貝貝殼的甲醇溶解成分。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用70%甲醇溶解成不同濃度的樣品〔2〕。

1.1.23T3-L1脂肪細(xì)胞株 JCRB9014（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司提供）。

1.1.3 藥品及試劑 DMEM、NaHCO3、 抗生素（ penicillin-streptomycin）、牛胎兒血清（ FCS）、維生素C、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、Oil Red“ O”染色劑、3.7%甲醛、trtonX-100、葡萄糖及牛血清蛋白（BSA）等，以上試劑均為分析純，由上海泛柯生物科技有限公司和海德創(chuàng)業(yè)（北京）生物科技有限公司提供。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)SHELLAB）、紫外分光光度儀（日本島津）、生物顯微鏡（奧林巴斯）、24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿、10 cm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液的組成及配制 ①基礎(chǔ)培養(yǎng)液：取DMEM 1.348 g、NaHCO30.37 g、 抗生素溶液200 μL、FCS 5 mL、維生素C 3.5 mg，脫離子水定容至100 mL，溶解后濾過(guò)滅菌備用；②無(wú)血清培養(yǎng)液：取DMEM 1.348 g、NaHCO30.37 g、 抗 生 素 溶 液200 μL、維生素C 3.5 mg，加脫離子水容積至100 mL，溶解后濾過(guò)滅菌備用；③分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液：取DMEM 1.348 g、NaHCO30.37 g、 抗生素溶液200 μL、FCS 5 mL、維生素C 3.5 mg、25 mM地塞米松0.25 μL、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤11.1 mg、胰島素1 mg，加脫離子水定容至100 mL，溶解后濾過(guò)滅菌備用；④細(xì)胞成熟培養(yǎng)液：取DMEM 1.348 g、NaHCO30.37 g、抗生素溶液200 μL、FCS 5 mL、 維生素C 3.5 mg、 胰島素5 mg，加脫離子水定容至100 mL，溶解后濾過(guò)滅菌備用。

1.2.2 PBS和KRP緩沖液的組成及配制 ①PBS緩沖液：NaCl 4 g、Na2HPO40.55 g、KCl 0.1 g、KH2PO40.1 g，加脫離子水定容至500 mL，高壓滅菌后備用；②KRP緩沖液：NaCl 0.7 g、KCl 35.8 mg、CaCl214.7 mg、MgSO429.6 mg、Na2HPO422.3 g、NaH2PO4104.3 mg、葡萄糖193 mg、BSA 2 g，維生素C 10 mg，加脫離子水定容至100 mL，溶解后濾過(guò)滅菌備用。

1.2.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化培養(yǎng)〔2〕將3T3-L1脂肪細(xì)胞解凍復(fù)蘇，置入10 cm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液8 mL，放入CO2培養(yǎng)箱（ 37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)，直至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；使用24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1脂肪細(xì)胞按每孔3.5×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)量注入，每孔添加基礎(chǔ)培養(yǎng)液1.5 mL，放入CO2培養(yǎng)箱（ 37 ℃、5%CO2） 中培養(yǎng)12 h；12 h后，去除上清液，用PBS溶液洗凈培養(yǎng)細(xì)胞2次，添加無(wú)血清培養(yǎng)液1.5 mL，放入CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h；12 h后，去除上清液，添加分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液1.5 mL，放入CO2培養(yǎng)箱（ 37 ℃、5%CO2）分化培養(yǎng)45 h后，除去上清液，用PBS緩沖液2次洗凈培養(yǎng)細(xì)胞，添加細(xì)胞成熟培養(yǎng)液1.5 mL，3 d交換一次成熟培養(yǎng)液，持續(xù)一周，得到分化成熟的實(shí)驗(yàn)用3T3-L1脂肪細(xì)胞。

1.2.4 3T3-L1脂肪細(xì)胞釋放出的游離甘油值測(cè)定使用上述分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，每孔內(nèi)分別加入KRP緩沖溶液200 μL，再按不同濃度加入扇貝貝殼（ 70%甲醇溶解）抽出液10 μL，（ 6孔一組濃度）。對(duì)照組加入70%的甲醇溶液10 μL，放入CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后，回收上清液，使用甘油測(cè)定試劑盒（購(gòu)于上海泛柯生物科技有限公司，日本進(jìn)口）測(cè)定3T3-L1脂肪細(xì)胞釋放的甘油值（按試劑盒所示方法進(jìn)行測(cè)定）。同樣方法，使用分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，加入不同濃度的異丙腎上腺素、珍珠甲醇抽出成分，測(cè)定3T3-L1脂肪細(xì)胞釋放的甘油值〔3〕。

1.2.5 3T3-L1脂肪細(xì)胞的Oil Red“O”染色 ①配制染色液：取Oil Red“ O”染色劑15 mg、丙醇5 mg，加脫離子水5 mL混合，濾紙過(guò)濾備用；②配制3.7%甲醛-PBS溶液：取37%甲醛溶液500 μL，加入PBS溶液4.5 mL；③配制0.1%trtonX-100-PBS溶液：取trtonX-1005 μL，加入PBS 5 mL；④細(xì)胞染色：使用上述分化培養(yǎng)成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，分別加入KRP溶液200 μL，實(shí)驗(yàn)組加入2.4 mg/mL扇貝貝殼甲醇抽取液10 μL（70%甲醇溶解），對(duì)照組加入70%甲醇10 μL，放入CO2培養(yǎng)箱（ 37 ℃、5%CO2） 中反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后除去上清液，用PBS緩沖液2次洗凈，分別加入3.7%甲醛-PBS溶液200 μL，室溫下固定細(xì)胞5 min；用PBS洗凈細(xì)胞，除去甲醛；分別加入0.1%trtonX-100-PBS溶液200 μL，室溫反應(yīng)5 min；用PBS洗凈細(xì)胞，分別加入Oil Red“ O”染色液200 μL，室溫下染色10 min，染色結(jié)束后，用脫離子水洗凈細(xì)胞，于顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)脂肪細(xì)胞中脂肪的染色情況。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.1 扇貝貝殼生物活性物質(zhì)促進(jìn)脂肪分解作用使用分化成熟的3T3-L1細(xì)胞，加入扇貝貝殼的抽取成分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出脂肪分解增強(qiáng)的作用，測(cè)定得出的甘油值與對(duì)照組相比有明顯的增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），升高程度呈濃度依存性。在濃度為4.9 mg/mL處，升高程度接近對(duì)照組的2倍，見(jiàn)圖1A。在對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂肪細(xì)胞脂肪進(jìn)行Oil Red“O”染色后的結(jié)果也顯示加入扇貝貝殼抽出成分的脂肪細(xì)胞內(nèi)被染成紅色的脂肪（甘油三酯）與對(duì)照組相比明顯減少，見(jiàn)圖2。

2.2 異丙腎上腺素促進(jìn)脂肪分解的作用 使用分化成熟的3T3-L1細(xì)胞，加入異丙腎上腺素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示脂肪分解增強(qiáng)的作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在濃度為10 nM時(shí)，與對(duì)照組相比，升高程度接近1.5倍，見(jiàn)圖1B。

2.3 珍珠抽出成分對(duì)脂肪分解的結(jié)果 與扇貝貝殼內(nèi)層有著同樣結(jié)構(gòu)機(jī)制構(gòu)成的珍珠抽出成分進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻沒(méi)有顯示出促進(jìn)脂肪分解的作用，見(jiàn)圖3。

圖1A 扇貝貝殼生物活性成分對(duì)脂肪分解的促進(jìn)作用

圖1B 異丙腎上腺素的促進(jìn)脂肪分解作用

圖2 3T3-L1脂肪細(xì)胞Oil Red“ O”染色

圖3 珍珠抽出成分對(duì)脂肪分解的作用

3 討論

傳統(tǒng)認(rèn)為脂肪組織是一種起著貯存中性脂肪、供應(yīng)能量、調(diào)節(jié)體溫等功能的組織，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)脂肪組織還是一個(gè)代謝活躍、功能復(fù)雜的內(nèi)分泌器官。人體的脂肪細(xì)胞能分泌數(shù)十種脂肪因子（adipocytokrilles）及蛋白質(zhì)因子，對(duì)全身各器官、組織（包括脂肪組織本身）有著重要的調(diào)節(jié)功能，故脂肪組織被稱為人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺體〔4〕。脂肪組織分為白色脂肪組織和褐色脂肪組織，白色脂肪組織的功能以儲(chǔ)存甘油三酯（脂肪）為主，是構(gòu)成動(dòng)物皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪的主要成分。本實(shí)驗(yàn)中使用的3T3-L1脂肪細(xì)胞，是一種能分化成白色脂肪細(xì)胞的細(xì)胞株，我們使用扇貝貝殼的甲醇（70%）抽出成分對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扇貝貝殼的抽出成分中含有促進(jìn)脂肪分解的生物活性成分，其對(duì)脂肪分解的活性程度不亞于異丙腎上腺素對(duì)脂肪的分解活性。在對(duì)實(shí)驗(yàn)脂肪細(xì)胞3T3-L1進(jìn)行的Oil Red“O”染色的結(jié)果，也直觀的顯示了扇貝貝殼抽出成分對(duì)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪的促分解作用。

脂肪分解需要激素敏感性甘油三酯脂酶（HSL）的參與，激素敏感性甘油三酯脂酶（HSL）的活化機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度增加、cAMP蛋白激酶的活化有關(guān)〔5〕，扇貝貝殼所含生物活性成分的促進(jìn)脂肪分解的機(jī)制是否與激活激素敏感性甘油三酯脂酶（HSL）機(jī)制有關(guān)尚不清楚，確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

另一方面，我們用同樣的評(píng)價(jià)方法對(duì)珍珠的甲醇抽出成分進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，珍珠抽出成分對(duì)脂肪細(xì)胞未顯示出促進(jìn)脂肪分解的作用（P＞0.05，圖3）。珍珠的構(gòu)成是霰石結(jié)晶，而扇貝貝殼的構(gòu)成是方解石結(jié)晶，可能由于構(gòu)成成分有異而顯示不同的作用〔6-8〕。由此推斷，促進(jìn)脂肪分解的活性成分可能僅存在于扇貝貝殼中。

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