黃立群，儀慧蘭，崔松林，郭軍

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006;2.山西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，山西太原030006;3.中國輻射防護研究院，山西太原030006)

中國大鯢Andrias davidianus俗稱“娃娃魚”，屬于兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動物。隱鰓鯢科有隱鰓鯢屬Cryptobranchus和大鯢屬Andrias 2個屬，共計3個種，其中隱鰓鯢屬的北美隱鰓鯢Cryptobranchus alleganiensis分布于美國東部，大鯢屬的日本大鯢Andrias japonicus和中國大鯢分別分布于日本和中國［1］。中國大鯢是中國特有的珍稀有尾兩棲動物，屬于國家二級保護動物，從水系看主要分布于長江中上游、珠江上游及黃河流域的部分地區(qū)［2］。楊麗萍等［3］對中國大鯢5個野生種群的遺傳多樣性和遺傳分化水平進行了研究，并結(jié)合化石證據(jù)，推測中國大鯢由北向南進行擴散。山西省翼城、垣曲、陽城、沁水四縣交界處的歷山是現(xiàn)今野生大鯢分布的最北端，歷山國家自然保護區(qū)的野生大鯢資源是中國大鯢重要的組成部分，可能在種群演化歷史中起到了重要作用。近年來，由于大鯢棲息地環(huán)境惡化以及人為亂捕濫殺，造成野生大鯢資源量銳減，部分地區(qū)瀕臨滅絕［4］。為此，開展大鯢群體遺傳學(xué)研究，確定中國大鯢不同種群之間的遺傳關(guān)系，對大鯢的人工繁育和種質(zhì)資源保護具有重要意義。

線粒體DNA(mtDNA)由于呈母系遺傳，且堿基替換速率快，無組織特異性，是兩棲類進化研究中重要的分子標記，被廣泛應(yīng)用于種群遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)及進化史等方面的研究中［5-6］。Cyt b由于進化速度適中，被認為是解決系統(tǒng)發(fā)育問題最可信的分子標記之一［7-9］，但單個線粒體基因在反映脊椎動物系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系時可能效果不佳［10］。為此，本研究中作者以mtDNA中Cyt b和ATPase 6序列為分子標記，比較了歷山野生大鯢與其他地域中國大鯢的序列差異，從分子水平上探討它們之間的相互關(guān)系，以期為大鯢的保護、繁殖和育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用野生大鯢2尾，于2010年取自歷山國家自然保護區(qū)，1號樣本取其肌肉組織，2號樣本采用大鯢自然生理過程中脫掉的皮，經(jīng)生理鹽水清洗后用體積分數(shù)為75%的乙醇浸泡，兩種樣品均在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 大鯢組織用生理鹽水浸洗后，剪碎，稱取約50 mg置于1.5 mL離心管中，采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，經(jīng)TE溶解后用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 PCR擴增及測序 PCR擴增時Cyt b引物參考Murphy等［11］的引物序列，ATPase 6引物為自行設(shè)計引物 (表1)，PCR反應(yīng)程序:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，退火30 s，72℃下延伸40 s，共進行30個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。退火溫度分別為51℃和57℃。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，回收目的條帶送華大基因公司測序。

表1 PCR擴增引物Tab.1 Primers used in PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)處理

為了比較大鯢種群線粒體序列變異，從NCBI上收集到已知來源的中國大鯢樣本14尾 (表2)。中國大鯢樣本按地域來源及水系進行編號，其中AH代表安徽樣本，GX代表廣西樣本，HN代表湖南樣本，SC代表四川樣本，ShX代表陜西樣本，SX代表山西 (垣曲)樣本;Y代表黃河水系，YZ代表長江水系，P為珠江水系;SX1-Y和SX2-Y為所測歷山樣本。

使用軟件Geneious Pro 5.1.7輔助人工校對DNA序列，相關(guān)序列的收集、比對由Geneious軟件完成［12］。用Mega 5.0軟件統(tǒng)計序列之間的堿基差別，計算核苷酸使用頻率，采用ML(Maximum likelihood)法和MP(Maximum parsimony)法分別構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，ML采用Kimura雙參數(shù)模型，Bootstrap 1000循環(huán)檢驗結(jié)果為各分支的置信度。

表2 大鯢樣本來源Tab.2 The samples of Chinese giant salamander collected from different areas

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

目前，國內(nèi)學(xué)者普遍采用大鯢肌肉或肝臟組織提取DNA，但Matsui等［13-14］曾從大鯢腳趾尖、尾尖及表皮中提取DNA。大鯢在飼養(yǎng)過程中會經(jīng)常脫皮 (10～30 d脫皮一次)［15］，本試驗中嘗試采用常規(guī)酚-氯仿抽提法從2號大鯢樣本所脫皮中提取DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測，所提DNA樣品產(chǎn)生單一條帶，純度高，無降解，與肌肉來源的DNA相似。這說明，對于大鯢這樣的珍稀保護動物，完全可以采用非損傷取樣進行分子遺傳學(xué)研究。

2.2 Cyt b區(qū)域DNA序列的組成與變異

測定和收集了中國大鯢6個不同地理區(qū)域16個樣本的Cyt b基因序列，有效片段長為305 bp，共發(fā)現(xiàn)10個不同的單倍型。對核苷酸序列進行分析，共檢測出14個變異位點 (圖1-A)，占核苷酸總數(shù)的4.58%，其中有12個簡約信息位點，多數(shù)變異發(fā)生在密碼子的第3位點上 (占64.3%)，第1、第2位點變異數(shù)分別占總變異數(shù)的28.6%和7.1%。沒有任何堿基的插入或缺失，其中A、T、G和 C堿基平均含量分別為23.9%、35.1%、18.9%和22.1%，堿基組成的百分比顯示了G的相對缺乏，A+T平均含量為59%，G+C含量為41%。核苷酸的替換以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換遠多于顛換(13/1)，表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)換偏倚［16］，其中A←→G轉(zhuǎn)換 (8)比T←→C(5)轉(zhuǎn)換略多。

圖1 歷山大鯢Cyt b和ATPase 6序列多態(tài)性位點分布Fig.1 Polymorphic sites in the Cyt b and ATPase 6 sequences of Chinese giant salamander in Lishan region

2.3 ATPase 6區(qū)域DNA序列的組成與變異

檢測ATPase 6基因序列有效片段長為371 bp，有13個不同的單倍型，發(fā)現(xiàn)30個變異位點，占核苷酸總數(shù)的8.09%(圖1-B)，其中有18個簡約信息位點，多數(shù)變異發(fā)生在密碼子的第3位點上(占50%)，第1、第2位點變異數(shù)分別占總變異數(shù)的43.3%和6.7%。沒有堿基的插入或缺失，其中A、T、G和 C堿基平均含量分別為 29.1%、35.2%、12.3%和23.4%，堿基組成百分比同樣顯示了G的相對缺乏，A+T平均含量為64.3%，而G+C含量只有35.7%。核苷酸的替換以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換遠多于顛換 (22/8)，同樣表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)換偏倚，其中A←→G轉(zhuǎn)換 (14)也多于T←→C轉(zhuǎn)換 (8)。與Cyt b序列相比，ATPase 6序列具有更高的變異度，但兩序列堿基組成同樣表現(xiàn)出了G的缺乏，多數(shù)變異發(fā)生在的密碼子的第三位，且變異以轉(zhuǎn)換為主。

2.4 分子系統(tǒng)樹

大鯢種群地理關(guān)系比較復(fù)雜，因此采用ML和MP兩種方法構(gòu)建6個不同地理區(qū)域中國大鯢Cyt b和ATPase 6合并序列的分子系統(tǒng)樹。合并序列全長為676 bp，以新疆北鯢Ranodon sibiricus作為外群，Bootstrap 1000次循環(huán)檢驗結(jié)果作為各分支的置信度 (圖2)。兩種方法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹具有基本相同的拓撲結(jié)構(gòu)，拓撲結(jié)構(gòu)分為3個分支，其中安徽個體聚在一起為一單獨分支，廣西個體和湖南一個體聚為一支，而山西、陜西、四川及湖南兩個體聚為另一分支。歷山大鯢樣本與廣西樣本的遺傳距離最遠，為0.032，與四川、陜西樣本的遺傳距離較近。長江流域種群與黃河流域種群共享有單倍型HN1-YZ(SX1-Y)，長江流域種群與珠江流域種群共享有單倍型GX2-P(HN2-YZ)，而黃河流域與珠江流域的地理種群沒有共享的單倍型。從流域來看，黃河流域大鯢聚在第1分支，珠江流域大鯢聚在第2分支，長江流域大鯢則分布于第3分支。由此可見，大鯢的遺傳分化呈現(xiàn)出地理區(qū)域上的連續(xù)性:長江流域介于黃河流域和珠江流域之間，其種群與其它種群之間遺傳距離較近且存在交叉，而黃河流域與珠江流域種群沒有交叉，這與陶峰勇等［17］的研究結(jié)果一致。

圖2 以Cyt b和ATPase 6合并序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹Fig.2 Molecular phylogenetic trees based on the combined sequences of Cyt b and ATPase 6 genes

3 討論

中國大鯢遷徙能力差，對水環(huán)境的依賴性很大，且不同水系種群間的基因交流不太可能，部分地區(qū)種群可能形成獨特的種群遺傳特征。中國大鯢主要分布于23.5～35°N的區(qū)域，本研究中大鯢樣本采集于歷山地區(qū)35°12'N處。歷山作為現(xiàn)今中國大鯢分布的最北端，研究其種群結(jié)構(gòu)及遺傳特性對于大鯢種質(zhì)資源的保護具有重要意義。本研究結(jié)果表明:2尾歷山大鯢基因序列在個別位點有地域特異性，歷山大鯢與四川、陜西樣本的遺傳距離較近，與廣西樣本的遺傳距離最遠。分析不同來源16個樣品核苷酸序列的差異，所測ATPase 6序列變異率比Cyt b序列高，但兩基因序列堿基組成同樣表現(xiàn)出了鳥嘌呤的缺乏，多數(shù)變異發(fā)生在密碼子第3位，且變異以轉(zhuǎn)換為主。本研究中雖然收集的大鯢樣品數(shù)量有限，只檢測了2段常用DNA分子標記序列，但還是能夠說明中國大鯢不同地理位置種群間存在遺傳差異，歷山野生大鯢種群具有一定的遺傳特征。Murphy等［11］在對中國大鯢mtDNA序列分析的基礎(chǔ)上，認為安徽黃山大鯢為一單獨分支，具有獨特的遺傳特征，但沒有確定出三流域之間地理種群的親緣關(guān)系。本研究中，作者認為長江流域種群可能充當了黃河流域種群與珠江流域種群的橋梁作用。

歷山地區(qū)大鯢分布比較集中，主要位于李家河上游部分溪流中。山西省曾于1984年對歷山地區(qū)大鯢資源進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大鯢主要分布于同善公社東北角和銅礦峪一帶。2010年作者對大鯢棲息地調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，銅礦峪地區(qū)由于銅礦的開發(fā)，河道污染嚴重，大鯢已經(jīng)絕跡，另一主分布區(qū)西陽河上游西哄哄段大鯢數(shù)量也急劇減少。因此，保護歷山野生大鯢資源刻不容緩。

目前，大鯢人工繁殖及規(guī)模化繁育技術(shù)已取得成功［18］，種群數(shù)量已有所恢復(fù)，但其種群多樣性短期內(nèi)仍難以有效恢復(fù)［19］。Lin 等［20］通過 RAPD分析了大鯢親本及子二代的多樣性，發(fā)現(xiàn)子二代的多樣性遠遠低于親本。因此，保護野生大鯢種群對于保護大鯢資源并有效利用其資源具有重要意義。歷山地區(qū)是野生大鯢分布區(qū)域中緯度最高的地域，其大鯢種群在中國大鯢資源中占有不可替代的重要位置。在有關(guān)部門的倡導(dǎo)與資助下，垣曲縣境內(nèi)成立了山西省首個大鯢保護繁育站，但由于資金、設(shè)施及配套管理措施不到位，尤其是專業(yè)技術(shù)人員的缺乏，工作難度較大，亟待多方的大力支持。

致謝:本研究得到了山西省水產(chǎn)科學(xué)研究所、垣曲縣水利局和歷山大鯢保護繁育站的大力支持，在此表示感謝!

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