方珍珍，景宏麗，江育林，張利峰，張旻，李華

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)系，天津300384;3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100029;4.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京100026)

草魚出血病是一種具高度傳染性和致死性的病毒性魚病，該病流行于中國(guó)各地草魚養(yǎng)殖區(qū)，尤以長(zhǎng)江流域和廣東、廣西、福建最為普遍，死亡率高達(dá)80%，嚴(yán)重影響了草魚Ctenopharyngodon idellus養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。1972年首次報(bào)道該病，1978年確定為病毒病，1980年首次在病魚的頭腎切片中觀察到呈晶格狀排列的病毒粒子，1984年確定草魚出血病病原為呼腸孤病毒［1-2］。草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)是中國(guó)分離、鑒定的第一株水生動(dòng)物病毒，對(duì)該病毒的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、流行病學(xué)、理化及分子生物學(xué)等方面已進(jìn)行了系統(tǒng)的研究［3-8］。

草魚呼腸孤病毒的基因組由11個(gè)dsRNA片段組成，不同的毒株間病毒基因組的總分子質(zhì)量差異不大 (相對(duì)分子質(zhì)量約15×106)，但各片段分子質(zhì)量有所差異。近年來(lái)，方勤等［9］通過(guò)序列分析和三維結(jié)構(gòu)研究表明，成熟的GCRV顆粒由7種結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中病毒蛋白VP5和VP7構(gòu)成了病毒的外層衣殼組分。通過(guò)蛋白酶裂解試驗(yàn)揭示了VP5和VP7在病毒感染及致病中起著不可替代的作用。此外，VP5還可進(jìn)行構(gòu)象的改變，其作用是保證膜穿透［10-12］，同時(shí)VP5也是GCRV的衣殼蛋白，可能具有較高的免疫原性。

關(guān)于草魚出血病的檢測(cè)，電鏡觀察是最直觀而有效的方法，在最初的研究中應(yīng)用較多，但是存在著技術(shù)和儀器要求以及樣品制備復(fù)雜等問(wèn)題［13］。分子檢測(cè)技術(shù)PCR方法雖然具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，但由于存在假陽(yáng)性，在結(jié)果判定上容易出現(xiàn)不確定性，并且難以判斷是具有完整病毒粒子還是僅存在殘余的病毒核酸［14-16］。因此，用于抗原檢測(cè)的免疫學(xué)方法可以作為確診的重要依據(jù)。而免疫學(xué)方法的應(yīng)用需要一定量的抗血清，通常采用滅活毒株免疫動(dòng)物獲得免疫血清，但這種方法需要增殖大量的病毒并對(duì)其純化，血清生產(chǎn)成本高，過(guò)程復(fù)雜，制約了抗血清的大量獲得。本研究中，作者在對(duì)GCRV基因序列分析的基礎(chǔ)上，選擇病毒的外殼蛋白VP5基因進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建和蛋白表達(dá)，以期得到人工表達(dá)的病毒外殼蛋白，旨在為該病毒單克隆抗體和多克隆抗體的制備，以及免疫檢測(cè)試劑盒的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株和載體 毒株GCRV-873為中科院武漢病毒所贈(zèng)送;pET-30α質(zhì)粒購(gòu)自Novagen公司;大腸桿菌E.coli DH5α、大腸桿菌BL-21(DE3)、RNA提取試劑盒 (硅基質(zhì)膜吸附法)、Quant一步法RT-PCR試劑盒 (高效逆轉(zhuǎn)錄酶)、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技 (北京)有限公司;限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司;蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自 Fermentas公司;Ni-NTA HisBind融合蛋白純化購(gòu)自MERCK公司。

1.1.2 引物 根據(jù)GenBank中的序列(登錄號(hào)AF239175)設(shè)計(jì)引物GCRV-U和GCRV-D分別為5'GAGCTCGGACTTCGCACTCTCTCTACAATG3'，5'CTCGAG AA GTTCACGCGGGCATGGAAG 3'。上游引物引入SacⅠ位點(diǎn)，下游引物引入XhoⅠ位點(diǎn)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GCRV-873病毒總RNA的提取和RTPCR擴(kuò)增 使用RNA提取試劑盒提取總RNA。取總RNA 10 μL配制50 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行 RTPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:先在50℃下反轉(zhuǎn)錄30 min，再于94℃下預(yù)變性2 min;然后在94℃下變性1 min，在60℃下退火1 min，在72℃下延伸2 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的亞克隆 取PCR回收產(chǎn)物用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，用10 g/L瓊脂糖凝膠回收目的片段;pET-30α質(zhì)粒同樣用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切、回收。取經(jīng)酶切處理的1 μL pET-30α質(zhì)粒、5 μL GCRV-VP5基因 PCR 產(chǎn)物、1 μL T4 DNA連接酶和1 μL 10×連接酶buffer，在16℃下連接12 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性菌落克隆，陽(yáng)性菌落經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切鑒定后，送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)和目的蛋白的檢測(cè) 挑取測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功的pET-30α重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素 (Kan)的固體LB平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。分別挑取帶有重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的單克隆菌落接種于3 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃下?lián)u床培養(yǎng)過(guò)夜。次日轉(zhuǎn)接種至50 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃下?lián)u床培養(yǎng)至光密度值OD600nm=0.6。每個(gè)克隆選取一瓶，加入原始濃度為1 mol/L的IPTG培養(yǎng)液，至終濃度為1 mmol/L，并于37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，分別離心收集菌體并超聲破碎，將離心后的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.4 包涵體的粗提和洗滌 取1 L菌液，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［17］有關(guān)方法，以低速離心收集沉淀，將沉淀重懸于細(xì)胞裂解液 (50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH 8.0)中，用功率為400 W的超聲按照作用3 s、間隔3 s進(jìn)行處理，直至菌液澄清。以4 000 g離心15 min，棄上清，收集沉淀，除去大部分可溶菌體蛋白。將沉淀于含有Triton-100的細(xì)胞裂解液中洗滌2～3次，進(jìn)一步去除雜蛋白和雜質(zhì)。最后收集沉淀，于-20℃下保存。

1.2.5 融合蛋白的純化 將洗滌后的包涵體用含8 mol/L尿素的PBS緩沖液完全溶解，經(jīng)帶有Ni-NTA HisBind的樹(shù)脂混勻，用柱層析純化融合目的蛋白，用含4 mol/L尿素的透析液 (0.1 mol/L NaH2PO4、0.01 mol/L Tris-Cl，pH 8.0)進(jìn)行透析，然后逐步降低尿素濃度至零，透析48～60 h后，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 Western blotting分析 取純化后的融合蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的脫脂奶粉封閉過(guò)夜。次日進(jìn)行Western blotting試驗(yàn)，分別以His·Tag單克隆抗體和羊抗GCRV抗血清作為一抗，于37℃下孵育1 h，用1×PBST洗滌3次。加入用HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的抗鼠二抗和抗羊二抗，于37℃下孵育1 h，再用1×PBST洗滌3次，加入DAB顯色，用去離子水終止反應(yīng)。

1.2.7 多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)的檢測(cè) 將純化病毒和表達(dá)蛋白分別作為抗原免疫山羊，共免疫4次。第一次基礎(chǔ)免疫:抗原與弗氏完全佐劑按1∶1混合，皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為1 mg/只。一周后加強(qiáng)免疫一次:抗原與弗氏不完全佐劑按1∶1混合，皮下注射，免疫劑量為1 mg/只。之后每隔一周加強(qiáng)免疫一次，注射劑量加倍。4次免疫后采血，分離血清，用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 重組克隆的鑒定

從細(xì)胞培養(yǎng)的GCRV-873病毒懸液提取總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增GCRV-VP5基因，得到約為2 005 bp的PCR產(chǎn)物 (圖1)。PCR產(chǎn)物克隆至pET-30α質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21(DE3)中，挑取過(guò)夜生長(zhǎng)的菌落，進(jìn)行小量培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用SacⅠ和XhoⅠ做酶切鑒定，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可得到2 005 bp的DNA目的條帶 (圖2)，并鑒定為陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pET-30α-GCRV-VP5。菌落經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性，顯示克隆成功。

圖1 GCRV-873病毒VP5基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of GCRV-873 strain VP5 gene

圖2 重組質(zhì)粒pET-30α-GCRV-VP5的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombination plasmid pET-30α-GCRV-VP5 by enzyme digestion

測(cè)序結(jié)果顯示，該基因序列與GenBank公布的AF239175相似性達(dá)99%，提示已成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30α-GCRV-VP5。

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析

誘導(dǎo)表達(dá)后，細(xì)胞經(jīng)超聲處理，上清與沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果顯示，目的蛋白大部分在超聲后的沉淀中，提示表達(dá)產(chǎn)物主要以不可溶的包涵體形式存在(圖3(a))。

2.3 融合蛋白的純化

將包涵體用Ni-NTA HisBind樹(shù)脂將目的蛋白純化，透析后進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，可得到純度較高的蛋白，經(jīng)測(cè)定其質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL(圖3(b))。

2.4 重組蛋白的Western blotting鑒定

對(duì)純化后重組蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示，以His·Tag單克隆抗體為抗體，在硝酸纖維素膜相對(duì)分子質(zhì)量為77 000處出現(xiàn)一特異性反應(yīng)條帶(圖4(a))，同時(shí)以羊抗GCRV抗血清為抗體，也可出現(xiàn)相同分子質(zhì)量大小的特異性反應(yīng)條帶(圖4(b))，證實(shí)了相對(duì)分子質(zhì)量為77 000處的條帶為含有目的蛋白的融合表達(dá)產(chǎn)物。

2.5 多克隆抗體的效價(jià)

分別用病毒和表達(dá)蛋白作為抗原，對(duì)免疫山羊4次后獲得的抗血清，用ELISA法測(cè)得抗體的效價(jià)均在10-4。表明兩種抗原均可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生良好的體液免疫反應(yīng)。

3 討論

本研究中對(duì)GCRV-VP5基因進(jìn)行了人工表達(dá)，用表達(dá)的重組蛋白作為抗原，免疫動(dòng)物并使之產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，表達(dá)的需要量較大，為此構(gòu)建了原核表達(dá)體系。將RT-PCR擴(kuò)增出的目的條帶連接到表達(dá)質(zhì)粒pET-30α中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)后重組菌在相對(duì)分子質(zhì)量約為77 000處出現(xiàn)一條蛋白條帶，提示感受態(tài)菌可能表達(dá)了含有目的蛋白的融合表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)Western blotting鑒定，該條帶可以與His·Tag抗體和羊抗GCRV抗血清特異性結(jié)合，表明在相對(duì)分子質(zhì)量為77 000處的條帶的抗原性和病毒蛋白的抗原性相似，也表明其中含有目的蛋白的融合表達(dá)產(chǎn)物。而利用pET-30α質(zhì)粒載體系統(tǒng)表達(dá)的外源基因，表達(dá)蛋白帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)記，因6×His很小，所以不會(huì)影響表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，無(wú)需用蛋白酶把6×His切除［18］。而且6×His免疫原性差，融合蛋白可直接用作抗原產(chǎn)生所需的抗體。

圖3 重組蛋白的表達(dá)和包涵體的洗滌及重組蛋白的純化Fig.3 Expression of recombinant proteins and washing，and purification of recombinant proteins

圖4 重組蛋白與His·Tag單克隆抗體、羊抗GCRV抗血清進(jìn)行免疫印跡Fig.4 Western blot analysis by recombinant proteins with His·Tag monoclonal antibodies，and goat anti-GCRV serum

本研究中在37℃下誘導(dǎo)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，該融合產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，缺乏一些蛋白折疊過(guò)程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，是包涵體形成的原因之一［19］。但蛋白以包涵體形式出現(xiàn)，其蛋白的自然結(jié)構(gòu)和抗原活性都會(huì)受到很大影響，為此進(jìn)行了包涵體的洗滌、溶解、純化、復(fù)性。本試驗(yàn)中首先通過(guò)物理方法超聲破碎對(duì)表達(dá)菌進(jìn)行裂解。由于菌體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白常常與包涵體粘連在一起，因此在溶解包涵體之前的洗滌非常重要。本研究中參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［17］對(duì)包涵體進(jìn)行了洗滌，取得了較好的洗滌效果。對(duì)包涵體進(jìn)行溶解純化后，如何將其轉(zhuǎn)化成有活性的蛋白，其中蛋白質(zhì)的復(fù)性是非常重要的一步。在實(shí)驗(yàn)室中，一般采用傳統(tǒng)的稀釋和透析方法進(jìn)行復(fù)性。由于多肽鏈之間的聚集容易造成蛋白質(zhì)沉淀，而蛋白質(zhì)的濃度是引起多肽鏈聚集的主要因素。通常蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度控制在0.1～1.0 mg/mL。變性蛋白經(jīng)過(guò)尿素處理至可溶以后，再逐漸滴加到復(fù)性液中使之復(fù)性。但如果加到復(fù)性液中的速度過(guò)快，就容易形成絮狀沉淀，這可能是蛋白重新凝聚的緣故［20］。為此，Mayer等［21］設(shè)計(jì)了一種緩慢透析法，用8 mol/L的尿素溶液作為起始透析液，然后逐漸稀釋降低透析外液的尿素濃度。變性劑濃度連續(xù)緩慢下降，有助于減少蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中沉淀的出現(xiàn)，提高活性蛋白質(zhì)的收率。因此，本研究中選擇透析復(fù)性，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，復(fù)性后離心僅有少量沉淀，復(fù)性效果較好。

本試驗(yàn)中制備的兩種多克隆抗體均有較高的效價(jià)，且效價(jià)水平相差不大，說(shuō)明兩種抗原均可刺激動(dòng)物產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)。對(duì)比而言，表達(dá)蛋白制備的多抗較病毒制備的多抗靈敏度和特異性要好一些。因此，表達(dá)的重組蛋白可以應(yīng)用于ELISA等免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究。重組蛋白的成功表達(dá)和復(fù)性為今后GCRV單克隆抗體的制備提供了較好的方法，也為進(jìn)一步制備免疫學(xué)方面的檢測(cè)試劑盒研究工作提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］陳燕新，江育林.草魚出血病病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)及其理化特性的研究［J］.科學(xué)通報(bào)，1983，28:1138-1140.

［2］中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所沙市分所草魚出血病病毒研究協(xié)作組.草魚出血病病毒的電子顯微鏡觀察初報(bào)［J］.淡水漁業(yè)，1983(3):39-40.

［3］柯麗華，方勤，蔡宜權(quán).一株新的草魚出血病病毒分離物的特性［J］.水生生物學(xué)報(bào)，1990，14(2):153-159.

［4］方勤，柯麗華，蔡宜權(quán).草魚出血病病毒的生長(zhǎng)特性及高滴價(jià)培養(yǎng)［J］.病毒學(xué)雜志，1989，4(3):315-319.

［5］黃捷，柯麗華，蔡宜權(quán).草魚出血病病毒的RNA轉(zhuǎn)錄酶活性研究［J］.病毒學(xué)報(bào)，1992，8(1):50-56.

［6］王煒，蔡宜權(quán)，方勤，等.草魚出血病病毒多肽的基因定位［J］.中國(guó)病毒學(xué)，1994，9(4):356-361.

［7］Fang Qin，Attoui H，F(xiàn)rancois J，et al.Sequence of genome segments 1，2 and 3 of the grass carp reovirus(genus Aquareovirus，family Reoviridae)［J］.BBRC，2000，274(3):762-766.

［8］Qiu Tao，Lu Ren-hou，Zhang Jiang，et al.Complete nucleotide sequence of the S10 genome segment of grass carp reovirus(GCRV)［J］.DAO，2001，44:69-74.

［9］方勤，Shah S.草魚呼腸孤病毒的三維重構(gòu)與衣殼蛋白特性［J］.生命科學(xué)，2005，35(3):231-237.

［10］Fang Q，Seng E K，Ding Q Q.Characterization of infectious particles of grass carp reovirus by treatment with proteases［J］.Arch Viro，2008，153(2):675-682.

［11］Ivanovic T，Agosto M A，Nibert M L.A role for molecular chaperone Hsc70 in reovirus outer capsid disassembly［J］.Biol Chem，2007，282(16):12210-12219.

［12］王煒，趙桃英，方勤.草魚出血病病毒多肽的免疫原性［J］.中國(guó)病毒學(xué)，1995，10(2):166-168.

［13］消波.草魚呼腸孤病毒及其免疫防治研究進(jìn)展［J］.魯東大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，26(1):52-57.

［14］Yue Z Q，Teng Y，Liang C Z，et al.Development of a sensitive and quantitative assay for spring viremia of carp virus based on realtime RT-PCR［J］.J Viro Methods，2008，152:43-48.

［15］蘭文生，劉葒，高隆英，等.鯉春病毒血癥病毒糖蛋白的高效表達(dá)和純化［J］.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010，18(2):18-22.

［16］韓碩，趙前程，吳斌，等.傳染性造血器官壞死病毒毒株核蛋白基因片段的克隆及序列分析［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26(3):232-237.

［17］Sambrook J，Russell D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學(xué)出版社，2002.

［18］吳成龍，史成銀，黃捷，等.大菱鲆紅體病虹彩病毒主要衣殼蛋白基因在畢赤酵母中的重組分泌表達(dá)［J］.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2009，30(3):55-61.

［19］方敏，黃華梁.包涵體蛋白體外復(fù)性的研究進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2001，17(6):608-612.

［20］萬(wàn)雪，王磊，寧官保.包涵體及其復(fù)性研究概況［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2005(2):13-15.

［21］Mayer M，Buchner J.Refolding of inclusion on body proteins［J］.Methods Mol Med，2004，94:239-254.