李穎，周一兵，萬(wàn)良，趙歡，楊大佐

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

熱休克蛋白70(Hsp70)由于其具有多方面的生物學(xué)功能成為被廣泛研究的一組蛋白［1-2］。Hsp70作為蛋白成熟過(guò)程中的分子伴侶，能與變性蛋白質(zhì)結(jié)合，修復(fù)錯(cuò)誤折疊蛋白或加速其降解，參與應(yīng)激條件下細(xì)胞必需蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的維持，在對(duì)抗包括高溫、低氧、缺血、紫外線(xiàn)、重金屬離子、DNA損傷、環(huán)境毒物等環(huán)境脅迫引起的損傷中發(fā)揮重要作用［3-4］。同時(shí)，熱休克蛋白還具有抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗氧化、使生物獲得耐熱性、穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、免疫等生物學(xué)作用。正常條件下機(jī)體Hsp70表達(dá)量較少，外界環(huán)境脅迫下機(jī)體Hsp70表達(dá)量會(huì)明顯升高。鑒于Hsp70與環(huán)境脅迫引起的機(jī)體損傷之間的關(guān)系，Hsp70作為生物標(biāo)記物用于環(huán)境監(jiān)測(cè)受到廣泛關(guān)注。沈驊等［5-7］探討了鯽Carassius auratus肝臟組織Hsp70作為重金屬污染條件下生物標(biāo)記物的潛力。對(duì)Hsp70的初步研究結(jié)果顯示，Hsp70作為生物標(biāo)記物在水環(huán)境檢測(cè)方面具有一定潛力。Radlowska等［8］研究表明，高濃度重金屬污染可導(dǎo)致紫貽貝Mytilus edulis體內(nèi)Hsp70表達(dá)水平升高，且其表達(dá)量在銅、鎘聯(lián)合作用下變化更加顯著。另有研究表明，海膽、貝類(lèi)和多種魚(yú)類(lèi)體內(nèi)Hsp70表達(dá)量會(huì)隨著溫度變化發(fā)生顯著變化［9-12］。目前，已對(duì)多種海洋生物Hsp70基因序列和蛋白功能進(jìn)行了研究，然而對(duì)雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis Hsp70基因的研究迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。

雙齒圍沙蠶是廣泛分布于中國(guó)沿海潮間帶及河口潮灘的優(yōu)勢(shì)底棲動(dòng)物，隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)、多毛綱，是重要的經(jīng)濟(jì)多毛類(lèi)。由于其底棲生活習(xí)性，雙齒圍沙蠶受環(huán)境污染物影響的可能性增大，其對(duì)污染物的耐受性亦隨之增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，沙蠶對(duì)多種環(huán)境污染物如重金屬、多環(huán)芳烴等有較強(qiáng)的富集能力和污染耐受性［13］。深入開(kāi)展沙蠶熱休克蛋白研究，可從分子生物學(xué)水平探索其在沙蠶生理過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步分析重金屬脅迫條件下該基因?qū)?xì)胞和機(jī)體的保護(hù)作用，以及建立以沙蠶為模式生物的海洋污染沉積質(zhì)生物修復(fù)技術(shù)提供重要的參考依據(jù)。

本研究中，作者采用同源克隆及RACE技術(shù)首次從雙齒圍沙蠶體壁肌肉中克隆得到Hsp70基因，并進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)分析，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，將雙齒圍沙蠶Hsp70基因序列和其他已知Hsp70基因序列進(jìn)行了聚類(lèi)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用雙齒圍沙蠶采自遼寧省盤(pán)錦市雙臺(tái)子河口，選取體質(zhì)量為1.5～2.0 g的個(gè)體運(yùn)回到大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，于18℃水中暫養(yǎng)一周，每24 h更換海水1次。試驗(yàn)用海水取自大連市黑石礁海區(qū)，經(jīng)沉淀、沙濾后貯存?zhèn)溆?。試?yàn)海水的Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和 Cd(Ⅱ)的背景濃度分別為0.38、0.01、75.00、0.27、0.06 μg/L，鹽度為31～32，pH為8.25±0.10，溫度為 (18±0.5)℃。

RNAisoTMPlus、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、LA Taq?with GC Buffer、5'-Full RACE Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Ligaton Kit Ver.2.0(Code No.D6022)均購(gòu)自TAKARA公司;EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 研缽使用液氮預(yù)冷，取0.1 g雙齒圍沙蠶體壁肌肉，迅速放入預(yù)冷研缽中，加入適量液氮將組織研磨成粉末狀，再按照RNAisoTMPlus試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總 RNA，最終溶于DEPC處理水中。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)總RNA的完整性，并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度［14-16］。將提取的總RNA于-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)近源物種巨型管狀蟲(chóng)Riftia pachyptila部分基因熱休克蛋白Hsp70 CDS(GenBank登錄號(hào)為FN860145)尋找保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 (表1)。以雙齒圍沙蠶總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出特異性片斷，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定和比對(duì)。根據(jù)得到的Hsp70基因片段設(shè)計(jì)3'RACE和5'RACE引物。

1.2.3 第一鏈合成及特異性片段擴(kuò)增 取總RNA，按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA及PCR反應(yīng)。cDNA合成反應(yīng)條件:30℃下反應(yīng)10 min，42℃下反應(yīng)60 min，70℃下反應(yīng)15 min。同源克隆反應(yīng)條件:94℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。

表1 雙齒圍沙蠶Hsp70基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)Tab.1 Relative primers of Hsp70 gene cloning in Perinereis aibuhitensis

取5 μL PCR產(chǎn)物，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，再用EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit切膠回收試劑盒回收?；厥蘸蟮漠a(chǎn)物用DNA Ligaton Kit Ver.2.0(Code No.D6022)載體連接并進(jìn)行克隆，然后熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布于平板上，于37℃下過(guò)夜培養(yǎng)，挑選陽(yáng)性菌斑加至LB液體培養(yǎng)基 (含Amp)中培養(yǎng)16 h，送寶生物工程 (大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 RACE擴(kuò)增 使用引物CTD553 F/R進(jìn)行5'RACE和3'RACE擴(kuò)增，引物信息詳見(jiàn)表1。

1)5'RACE PCR擴(kuò)增

按照LA Taq?with GC Buffer和5'-Full RACE Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)總RNA進(jìn)行去磷酸化處理和“去帽子”反應(yīng)，并與5'RACE Adaptor連接后，反轉(zhuǎn)錄合成5'RACE的cDNA。采用巢式PCR方法擴(kuò)增沙蠶Hsp70 5'端序列，設(shè)立M-MLV(-)陰性對(duì)照。Outer PCR反應(yīng)使用引物CTD553 R173和5'RACE Outer Primer。Outer PCR反應(yīng)條件:94℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性30 s，65℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。Inner PCR反應(yīng)使用引物CTD553 R86 Primer和 5'RACE Inner Primer。Inner PCR反應(yīng)條件同Outer PCR。使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒切膠回收，回收后的產(chǎn)物使用DNA Ligation Kit Ver.2.0中的連接酶，與pMD20-T Vector連接，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布于平板上，于37℃下過(guò)夜培養(yǎng)，挑選陽(yáng)性菌落植菌并測(cè)序。

2)3'RACE PCR擴(kuò)增

使用LA Taq?進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，Outer PCR反應(yīng)使用引物CTD553 F437 Primer和3'RACE Out-er Primer。Outer PCR反應(yīng)條件:94℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。Inner PCR反應(yīng)使用引物CTD553 F534 Primer和3'RACE Inner Primer。Inner PCR反應(yīng)條件同 Outor PCR。切膠回收及克隆測(cè)序方法同5'RACE。序列測(cè)定由 TAKARA公司完成，應(yīng)用DNA Star軟件將得到的序列拼接成完整的cDNA序列。

1.2.5 序列分析 用DNA Star軟件翻譯序列，獲得編碼序列的氨基酸序列，用Blast對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì);用Clustal W和Mega 4.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析;用ProtParam和DNA Star預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)、等電點(diǎn)和分子質(zhì)量;用Tmhmm進(jìn)行跨膜區(qū)分析，用SignalP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，用ExPasy-ProtScale進(jìn)行疏水性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性片段擴(kuò)增及RACE擴(kuò)增

經(jīng)過(guò)DNase I純化處理后的總RNA用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，可清晰地看到5S、18S和28S核糖體 RNA條帶 (圖 1)。結(jié)果顯示，OD260nm/OD280nm為2.0左右，RNA有較高的完整性和均一性，無(wú)降解現(xiàn)象，符合基因克隆要求。

圖1 雙齒圍沙蠶RNA的提取結(jié)果Fig.1 The total RNA from P.aibuhitensis

根據(jù)巨型管狀蟲(chóng)Hsp70 CDS尋找保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物CTD553 F/R，經(jīng)PCR產(chǎn)物切膠后克隆測(cè)序得到574 bp的核苷酸序列 (圖2)。通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，3'RACE PCR擴(kuò)增得到931 bp核苷酸序列 (圖3-A)，5'RACE PCR克隆獲得819 bp核苷酸序列 (圖3-B)。經(jīng)DNA Star軟件進(jìn)行序列拼接，得到全長(zhǎng)為2 336 bp的雙齒圍沙蠶Hsp70 cDNA序列，并提交到 GenBank，登錄號(hào)為HQ449186。

圖2 Hsp70特異性片段擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification product of Hsp70 fragment

2.2 基因序列分析

序列分析顯示，雙齒圍沙蠶Hsp70基因cDNA包括5'非翻譯區(qū)88 bp、3'非翻譯區(qū)286 bp和開(kāi)放閱讀框?yàn)? 962 bp，整個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼653個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)雙齒圍沙蠶Hsp70的相對(duì)分子質(zhì)量為71 396，理論等電點(diǎn)為5.14，原子總數(shù)為10 036，分子式為C8645H13530N2378O2691S53。對(duì)Hsp70氨基酸序列的跨膜區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Hsp70無(wú)明顯跨膜結(jié)構(gòu)，推測(cè)其可能是可溶性蛋白。根據(jù)ProtScale預(yù)測(cè)結(jié)果，Hsp70疏水性最大值為1.944，最小值為-3.133，整個(gè)多肽鏈中大多數(shù)氨基酸的分值較低，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，故推測(cè)該蛋白可能為親水性蛋白。氨基酸序列分析表明，Hsp70存在 IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和 IVLVGGSTRIPKIQK 3個(gè)特征基序，并具有簡(jiǎn)并重復(fù)四肽GGMP。Hsp70氨基酸具有ATPase活性區(qū)，N端此活性區(qū)的保守性比C端更高。C末端具有以EEVD為特征的基序。

將雙齒圍沙蠶Hsp70序列提交到NCBI中，使用在線(xiàn)Blast軟件進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，雙齒圍沙蠶Hsp70與褐牙鲆 Paralichthys olivaceus Hsp71同源性為78%，與斑鱒屬Salmo salar Hsp70同源性為78%，與斑馬魚(yú)Danio rerio Hsp8同源性為78%，與脊尾白蝦 Exopalaemon carinicaud同源性為77%，與文昌魚(yú)Branchiostoma Hsp同源性為76%，與小鼠Mus musculus Hsp8同源性為76%，與長(zhǎng)牡蠣Crassostrea giga Hsc71同源性為77%，與鈴夜蛾屬Helicoverpa Hsp70同源性為76%，與中華絨鰲蟹Eriocheir sinensis Hsp70同源性為77%。雙齒圍沙蠶Hsp70氨基酸序列通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比較，經(jīng)Clustal W多重序列比對(duì)分析，用Mega 4.1構(gòu)建不同物種Hsp70基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) (圖4)。從圖4可見(jiàn):雙齒圍沙蠶和龐貝蠕蟲(chóng)Alvienlla pompejana、可口革囊星蟲(chóng)Phascolosoma esculenta的Hsp70親緣關(guān)系最近;稻飛虱Nilaparvata lugens和紅火蟻Solenopsis invicta等昆蟲(chóng)聚為一簇;人Homo sapiens、野豬Sus scrofa、非洲象Loxodonta africana、火雞Meleagris gallopavo、密西西比鱷Alligator mississippiensis、非洲爪蟾Xenopus laevis等脊椎動(dòng)物為一簇。

圖3 雙齒圍沙蠶Hsp70 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PCR amplified product of Hsp70 from P.aibuhitensis

圖4 不同物種Hsp70基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of Hsp70 gene in different species

3 討論

Hsp70基因在不同生物體內(nèi)均有分布，具有較高的保守性。Flynn等［17］研究表明，Hsp70氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)近N端具有相對(duì)分子質(zhì)量為45 000的高度保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有ATPase活性;Hsp70氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)近C端具有相對(duì)分子質(zhì)量為25 000的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括相對(duì)分子質(zhì)量為15 000的p2夾層結(jié)構(gòu)和相對(duì)分子質(zhì)量為10 000的螺旋結(jié)構(gòu)亞區(qū)。Hsp70家族具有 IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和 IVLVGGSTRIPKIQK 3個(gè)特征基序［18-21］以及C末端具有EEVD特征基序。本試驗(yàn)中，克隆獲得的雙齒圍沙蠶Hsp70序列也具有這些特征基序。

Hsp70 C末端的GGMP重復(fù)功能目前尚不清楚，相關(guān)資料表明，可能是分子伴侶因子的結(jié)合位點(diǎn)［22］，Piano等［23］認(rèn)為只有 Hsc70 才有 GGMP 四肽重復(fù)。但Boutet等［18］發(fā)現(xiàn)，食用牡蠣Crassostrea gigas的Hsp70和Hsc70氨基酸序列C末端均含有GGMP重復(fù)。目前報(bào)道的Hsp70有的含有GGMP四肽重復(fù)［18，24］，有的則沒(méi)有［23，25］。甚至同一物種會(huì)出現(xiàn)有或沒(méi)有兩種情況［22，26-27］。對(duì)本研究中克隆獲得的雙齒圍沙蠶Hsp70序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在其C末端具有GGMP四肽重復(fù)，對(duì)此末端重復(fù)功能還需要進(jìn)一步研究。

根據(jù)不同物種Hsp70氨基酸序列的比對(duì)分析結(jié)果，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，稻飛虱和紅火蟻等昆蟲(chóng)聚為一簇，人、野豬、非洲象、火雞、密西西比鱷、非洲爪蟾等脊椎動(dòng)物為一簇，雙齒圍沙蠶和龐貝蠕蟲(chóng)、可口革囊星蟲(chóng)的Hsp70親緣關(guān)系最近。這與雙齒圍沙蠶生物進(jìn)化情況相一致，可為今后環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)的系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化研究提供重要的參考依據(jù)。

利用Hsp70作為分子生物標(biāo)記，是目前海洋生物的一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域［28-29］。Kilemade 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒魚(yú)體內(nèi)Hsp70的表達(dá)水平與水生環(huán)境中2，4-二氯苯胺的含量有關(guān)，認(rèn)為水生生物體內(nèi)Hsp70的表達(dá)水平可以作為水生環(huán)境毒性的指標(biāo)。Veldhuizen-Tsoerkan等［31］將地中海貽貝Mytilus galloprovincialis放在污染水中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)水體污染物誘導(dǎo)的貽貝Hsp高度表達(dá)。Snyder等［32］觀察到貽貝和鮑魚(yú)Haliotis rufescens暴露在高熱和化學(xué)藥品超標(biāo)的水體中，其體內(nèi)的Hsp70、Hsp90和Hsp60含量均發(fā)生顯著變化。由此看出，Hsp70在防御應(yīng)急中發(fā)揮一定的作用。筆者將進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行分析，以期對(duì)多毛類(lèi)耐受環(huán)境污染的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，為建立海洋沉積質(zhì)污染早期生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)測(cè)評(píng)和評(píng)價(jià)方法提供重要的參考依據(jù)。

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