丁君，孫巍，常亞青

(大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

硬脂酰輔酶A去飽和酶 (Stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD)基因是調控飽和脂肪酸向單一不飽和脂肪酸轉化的關鍵酶，在脂肪酸生物合成中起著中心調控作用［2］，可通過信號傳導調控動物的采食量、能量代謝和機體內分泌等生理活動。SCD作為脂肪細胞分化的標記基因，其活性的高低會影響動物脂肪細胞的增殖和增長［3］。目前，有研究者已 對人［4-5］、雞［6］、豬［7-8］、綿羊［9］、山羊［10-11］、牛［12］、小鼠［13-14］和大鼠［15］等的 SCD 基因進行了克隆和測序，但對無脊椎動物SCD基因的研究較少。

蛋白酪氨酸磷酸酶 (Protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)基因是一種廣泛表達于細胞質并錨定在內質網上的磷酸酶，它是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)胞內酶的代表［16］。PTP1B基因沒有特異性受體，通過調節(jié)細胞內不同蛋白底物的酪氨酸磷酸化水平而參與各種細胞功能的調節(jié)。現(xiàn)已證實，PTP1B基因可與胰島素受體、表皮生長因子等某些受體型酪氨酸激酶及多種生長因子、底物互相作用，以調控細胞的生長分化［17］。

本研究中，作者查閱了KEGG數(shù)據庫中海膽脂肪酸代謝通徑，選取并克隆了SCD和PTP1B基因，檢測了SCD和PTP1B基因在海膽胚胎不同發(fā)育時期的表達情況，旨在為從分子水平上探討海膽脂代謝過程中的基因功能提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蝦夷馬糞海膽為農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室培育的2齡海膽。

Trizol Reagent、RNA PCR Kit(AMV)3.0、載體pMD19-T Vector均為寶生物工程 (大連)有限公司產品;異丙醇、分析乙醇、RnaseA、DEPC、MOPS、氨芐青霉素鈉鹽均為上海生工生物工程技術服務有限公司產品。SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit為美國Clontech公司產品;Gel Extraction Kit和Plasmid Miniprep Kit購自Omega Biotek公司;限制性內切酶購自 Promega公司;Tryptone、YeastExtract購自Oxoid公司;其它試劑均為國產分析純試劑。Taq DNA聚合酶聚核苷酸引物由寶生物工程 (大連)有限公司合成;大腸桿菌表達宿主為農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 設計與篩選 通過與加州紫海膽和馬糞海膽SCD、PTP1B基因序列的比對，找出保守序列，設計擴增片段引物SCD-F1、SCD-R1、PTP1BF1、PTP1B-R1(表 1)。

1.2.2 胚胎不同發(fā)育時期蝦夷馬糞海膽總RNA的提取、cDNA的合成及目的基因的PCR擴增 分別取發(fā)育至2細胞期、囊胚期、原腸期和八腕期的蝦夷馬糞海膽胚胎、幼蟲樣品各100 μL，提取總RNA，經瓊脂糖電泳檢測總RNA質量。

高中生傳統(tǒng)文化素養(yǎng)的缺失不僅通過上述問題反映出來，在其他很多方面也有所體現(xiàn)。究其原因，高中生對于傳統(tǒng)文化的掌握量少、獲取相關知識的途徑受限、學習研究的興趣不濃是多方面原因共同作用的結果。

使用TAKARA公司的cDNA Library Construction Kit試劑盒，利用反轉錄酶 M-MLV、Oligo(dT)18 Anchor Primer和5-methyldCTP合成第一鏈cDNA(含有NotⅠ 酶切位點)。

以cDNA為模板，根據所設計的上、下游引物進行PCR擴增，反應條件為:94℃下預變性5 min;94℃下變性1 min，57℃下退火1 min，72℃下延伸1 min，共進行30個循環(huán);最后在72℃下保溫10 min。PCR產物使用10 g/L的瓊脂糖電泳檢測，分離純化的目的基因片段連接到pMD19-T載體上，轉化至大腸肝菌DH5感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆進行測序。

1.2.3 采用RACE PCR技術獲得全長序列 采用cDNA末端快速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)，根據已經獲得的目的基因部分片段設計基因特異性引物進行5'cDNA和3'cDNA末端克隆。5'cDNA和3'cDNA末端克隆按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進行操作，PCR產物使用10 g/L瓊脂糖電泳檢測，分離純化的目的基因片段連接到pMD19-T載體上，轉化至大腸肝菌DH5感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆進行測序，將測序后的序列與以獲得的目的片段進行拼接，獲得cDNA全長。所用的特異性引物見表1。

表1 克隆SCD、PTP1B基因的主要引物Tab.1 The cloning primers of SCD and PTP1B genes

1.2.4 目的基因的生物信息學分析 測序結果用VecScreen(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Vec-Screen/VecScreen.html)去除載體序列，用bl2seq(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/bl2seq/wbl-ast2.cgi)進行比對拼接，得到各基因的全長cDNA序列;用ExPasy軟件包中的Compute pI/Mw tool(http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html.)預測等電點和分子質量，用the program SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)尋找信號肽序列;用Mega 4.0軟件中的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 用實時定量PCR法檢測目的基因的表達采用△△CT法檢測胚胎不同發(fā)育時期海膽SCD、PTP1B基因的表達，實時熒光定量PCR反應體系以cDNA第一鏈為模板，以β-actin作為內參基因，β-actin引物和目的基因定量引物經PCR擴增后電泳檢測無引物二聚體，且每對定量引物擴增出單一的含有已知序列的片段，再經預試驗對引物和模板濃度進行優(yōu)化，反應條件如下:94℃下預變性30 s;94℃下變性5 s，60℃下退火32 s，共進行30個循環(huán);最后在95℃下變性15 s，60℃下退火1 min，95℃下延伸15 s。

1.3 數(shù)據處理

實時熒光定量PCR結果由ABI step one Software系統(tǒng)進行分析，以β-肌動蛋白表達量校正目的基因的相對表達量。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析、標本重復性及組間差異的比較。

2 結果

2.1 總RNA的提取

經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測海膽胚胎的總RNA，可見清晰的28S、18S和5S 3條RNA條帶。表明總RNA沒有降解，提取的RNA質量較高。

2.2 蝦夷馬糞海膽SCD和PTP1B基因片段的PCR擴增

以總RNA逆轉錄得到的cDNA為模板，用設計的引物進行PCR擴增，獲得與預期大小一致的片段。將目的片段切膠回收、連接質粒后測序，得到440、630 bp兩條序列片段。

2.3 RACE-PCR擴增

以總RNA逆轉錄得到的5'RACE 1 st cDNA為模板，用設計的引物進行5'RACE擴增，獲得了與預期大小一致的424 bp的5'SCD片段和433 bp的5'PTP1B片段。

以總RNA逆轉錄得到的3'RACE 1 st cDNA為模板，用設計的引物進行3'RACE擴增，獲得了與預期大小一致的962 bp的3'SCD片段和488 bp的3'PTP1B片段。

2.4 蝦夷馬糞海膽SCD基因的序列分析

將用5'RACE、3'RACE引物獲得的SCD基因片段和用引物調取的SCD中間片段進行拼接，得到全長為1 934 bp的SCD基因cDNA序列 (Genbank登錄號為HM208174)，該序列包括153 bp的5'非編碼區(qū) (Untranslated region，UTR)、819 bp的開放閱讀框 (Open reading frame，ORF)和962 bp的3'非編碼區(qū)。推測的SCD基因cDNA多聚腺苷酸加尾信號 (Polyadenylation signal)為AATAA，開放閱讀框編碼273個氨基酸殘基，該多肽的理論相對分子質量為31 600，等電點為8.43。

使用SingaIP軟件分析蝦夷馬糞海膽SCD基因的氨基酸序列，表明SCD基因存在跨膜結構和信號肽，為分泌性蛋白。用Predict Protein軟件分析推測的SCD基因氨基酸序列含有以下位點:2個N-糖基化位點，1個蛋白酶C磷酸化位點，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，3個N-肉逗蔻酰化位點。多序列比對發(fā)現(xiàn)，不同物種的SCD基因中間部分序列保守性較高，序列兩端的差異性較大。

2.5 蝦夷馬糞海膽SCD基因的進化分析

采用Neibor-Joining方法構建不同物種SCD基因的系統(tǒng)進化樹。從圖1可見:蝦夷馬糞海膽與紫球海膽首先聚到一起，進化關系最近;魚類和哺乳動物也各自聚為一類。海膽在進化地位上位于脊椎動物和昆蟲之間。

圖1 不同物種SCD基因的系統(tǒng)進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of SCD gene in different species

2.6 蝦夷馬糞海膽SCD基因在胚胎不同發(fā)育時期的表達

利用實時定量PCR方法分析蝦夷馬糞海膽SCD基因在胚胎不同發(fā)育時期的表達。從圖2可見:隨著海膽胚胎的發(fā)育，SCD基因表達量呈逐漸升高趨勢。統(tǒng)計學分析結果顯示:SCD基因在八腕期的表達量顯著高于其他3個時期 (P＜0.01)，在2細胞期與囊胚期的表達量無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。

圖2 SCD基因在胚胎不同發(fā)育時期的表達情況Fig.2 The expression of SCD gene at different stages of embryonic development

2.7 蝦夷馬糞海膽PTP1B基因的序列分析

將用5'RACE、3'RACE引物獲得的PTP1B基因片段和用引物調取的PTP1B的中間片段進行拼接，得到全長為1 249 bp的PTP1B基因cDNA序列 (Genbank登錄號為HM208173)，該序列包括104 bp的5'非編碼區(qū)、657 bp的開放閱讀框和488 bp的3'非編碼區(qū)。推測的PTP1B基因cDNA多聚腺苷酸加尾信號為AATAA，開放閱讀框編碼219個氨基酸殘基，該多肽的理論相對分子質量為25 200，等電點為8.37。

用SingaIP軟件分析蝦夷馬糞海膽PTP1B基因的氨基酸序列，表明PTP1B存在跨膜結構和信號肽，為分泌性蛋白。用Predict Protein軟件分析推測的PTP1B基因氨基酸序列含有以下位點:1個N-糖基化位點，1個蛋白酶C磷酸化位點，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，3個N-肉逗蔻?；稽c，1個酪氨酸蛋白磷酸酶的活性位點。推測的PTP1B氨基酸序列含有兩個半胱氨酸 (Cys4和Cys58)，可形成二硫鍵。多序列比對發(fā)現(xiàn)，不同物種的PTP1B基因保守性較高。

2.8 蝦夷馬糞海膽PTP1B基因的進化分析

采用Neibor-Joining方法構建不同物種PTP1B基因的系統(tǒng)進化樹。從圖3可見，蝦夷馬糞海膽與紫球海膽先聚為一類，進化關系最近;哺乳動物聚為一類;海膽雖為后口動物，但進化地位仍低于魚類和兩棲類。

圖3 不同物種PTP1B基因的系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of PTP1B gene in different species

2.9 蝦夷馬糞海膽PTP1B基因在胚胎不同發(fā)育時期的表達

利用實時定量PCR方法分析蝦夷馬糞海膽PTP1B基因在胚胎不同發(fā)育時期的表達。從圖4可見，PTP1B基因表達量隨著海膽胚胎發(fā)育呈逐漸下降趨勢。統(tǒng)計學分析結果顯示:PTP1B基因在2細胞期表達量顯著高于其他3個時期 (P＜0.01)，在原腸期與八腕期的表達量無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。

3 討論

有關SCD基因克隆和測序多用于對哺乳動物和植物的研究，而對無脊椎動物的研究較少。本研究中成功克隆了蝦夷馬糞海膽SCD基因，推測SCD全長有273個氨基酸，存在信號肽，推測的SCD基因氨基酸序列有2個N-糖基化位點，1個蛋白激酶C磷酸化位點，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，3個N-肉豆蔻?；稽c。通?；蛑械墓δ芪稽c與蛋白質翻譯后的修飾、加工有關，其中N-糖基化位點能使蛋白質抵抗消化酶的作用，并且某些蛋白只有在糖基化之后才能正確折疊，具有傳導信號的功能［18］;蛋白激酶C磷酸化位點與介導胞外分泌有關［19］;酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點與調節(jié)細胞凋亡和細胞周期有關［20］，N-肉豆蔻?；稽c可能定位于內質網或線粒體外膜［21］，表明其為分泌性蛋白，參與介導胞外分泌。研究發(fā)現(xiàn)，蝦夷馬糞海膽SCD基因含有3個跨膜區(qū)域，這與現(xiàn)有報道的SCD基因均存在4個跨膜區(qū)域不同，其原因和效應還需進一步探討。SCD基因在不同物種中的序列保守性較高，本研究中通過比對蝦夷馬糞海膽與其他物種的SCD基因序列，發(fā)現(xiàn)SOD基因中部序列相對保守，C端和N端則缺乏同源性，這一結論與Man等［22］的研究結果一致。

圖4 PTP1B基因在胚胎不同發(fā)育時期的表達情況Fig.4 The expression of PTP1B gene at different stages of embryonic development

分析不同物種SCD基因的系統(tǒng)進化樹可知，蝦夷馬糞海膽和紫球海膽進化關系最近，海膽在進化地位上位于脊椎動物和昆蟲中間。因此，根據不同物種SCD基因序列構建的系統(tǒng)進化樹能較真實地體現(xiàn)蝦夷馬糞海膽SCD基因的分類地位。

推測的蝦夷馬糞海膽PTP1B全長有219個氨基酸，存在1個N-糖基化位點，1個蛋白酶C磷酸化位點，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，3個N-肉豆蔻?；稽c，1個酪氨酸蛋白磷酸酶活性位點，酪氨酸激酶位點與調控細胞增殖和分化、細胞周期以及從細胞外環(huán)境傳遞各種信號有關。實時定量PCR結果顯示，PTP1B基因表達量隨著海膽胚胎的發(fā)育呈逐漸下降趨勢。推測其與生長因子及底物互相作用，在胚胎發(fā)育的較早階段調控細胞的生長分化。

蝦夷馬糞海膽SCD、PTP1B基因的成功克隆及其在胚胎不同發(fā)育期的表達研究，對于深入探討棘皮動物脂肪酸代謝相關基因在胚胎不同發(fā)育時期的作用機制及調控機理具有重要意義，進而在分子水平上為蝦夷馬糞海膽的良種培育提供科學依據。

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