彭云吉 張志偉 趙強(qiáng) 劉重元 張婕 陳家明 賀修勝

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)是我國南方和東南亞地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)感染有著密切的關(guān)系[1]。EBV編碼的潛伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1， LMP1)是公認(rèn)的致瘤蛋白[2]。筆者前期采用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定，篩選到LMP1調(diào)節(jié)的Vimentin蛋白[3]，為了解LMP1-CTAR3與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在組織中的相關(guān)性，本文采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)LMP1調(diào)節(jié)的Vimentin蛋白在鼻咽上皮和鼻咽癌中的表達(dá)，擬揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2009年8月-2010年10月南華大學(xué)附一醫(yī)院病理確診的鼻咽上皮組織石蠟塊30例(其中男18例，女12例，平均年齡35歲)和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織石蠟塊60例(其中男41例，女19例，平均年齡44.5歲)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 將制備好的石蠟切片58 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中過夜；二甲苯脫蠟兩次后水化；PBS洗片3次，每次3 min；將切片浸入盛有枸櫞酸鹽緩沖液容器中微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)；加3%過氧化物酶阻斷液，37 ℃ 15 min；PBS洗片3次，每次3 min；加足量非免疫性動(dòng)物血清，37 ℃ 10 min；分別滴加一抗(抗LMP1蛋白與Vimentin蛋白抗體均為福建邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，編號(hào)：MAB-0063和 RMA-0547，克隆號(hào)：CS1-4和 SP20)，置濕盒中4 ℃冰箱過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃ 15 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃ 15 min；DAB顯色、蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、脫水、透明，封片，顯微鏡觀察、照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Vimentin蛋白的表達(dá)采用 χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LMP1蛋白在鼻咽上皮組織及鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) LMP1主要在細(xì)胞膜與細(xì)胞漿中表達(dá)(結(jié)果未顯示)，其中鼻咽上皮細(xì)胞的表達(dá)率為73.3%，而鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中表率為90%，提示慢性鼻炎和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者中EBV感染率高。見表1。

2.2 Vimentin蛋白在鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) Vimentin蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿(見圖1、2)，與LMP1(-)組織比較，Vimentin蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)升高(P<0.05)，提示LMP1促進(jìn)鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中Vimentin蛋白的表達(dá)。見表1。

圖1 Vimentin蛋白在鼻咽上皮組織中的表達(dá)(SP染色法，400倍)

圖2 Vimentin蛋白在鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)(SP染色法，400倍)

表1 鼻咽上皮與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中LMP1蛋白和Vimentin蛋白的表達(dá)

3 討論

鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染、飲食、地理及遺傳等因素有關(guān)，涉及多基因、多途徑和多階段的復(fù)雜生物學(xué)過程，屬于一種多基因遺傳性疾病[1-2]。為了解LMP1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，筆者前期工作獲得22個(gè)LMP1調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，如Vimentin蛋白等[3]。為了證實(shí)LMP1對(duì)不同蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，檢測(cè)了Vimentin蛋白在鼻咽上皮和鼻咽癌中的表達(dá)情況，為闡明LMP1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

波形蛋白(Vimentin)是一種中間絲蛋白，為細(xì)胞骨架成分，廣泛存在于間充質(zhì)細(xì)胞及中胚層來源的細(xì)胞中，其一端與核膜相連，另一端與細(xì)胞表面處的橋?；虬霕蛄Ｏ噙B，將細(xì)胞核和細(xì)胞器維持在特定的空間，主要起支撐作用[4]。Vimentin蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布很廣，與微管、微絲等形成完整的細(xì)胞支撐網(wǎng)絡(luò)[5]。大量資料表明[6]，Vimentin蛋白在多種人類上皮腫瘤如腎癌、甲狀腺、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等異常表達(dá)。有研究證實(shí)，乳腺癌中Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)與腫瘤局部浸潤和轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系[7]。本研究結(jié)果顯示，Vimentin蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌升高，提示LMP1可促進(jìn)鼻咽上皮與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中Vimentin蛋白的表達(dá)。Vimentin蛋白的表達(dá)升高提示，LMP1可促進(jìn)中間絲表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，使上皮細(xì)胞或癌細(xì)胞發(fā)生的上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]。LMP1介導(dǎo)的上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能促進(jìn)惡性增殖前鼻咽上皮細(xì)胞的惡變[9]。轉(zhuǎn)化生長因子-β涉及正常上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，伴隨著細(xì)胞骨架重塑、E-鈣粘蛋白表達(dá)下降及Vimentin蛋白表達(dá)升高[10]。結(jié)合鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中EBV的高感染及易早期轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，推測(cè)LMP1上調(diào)Vimentin蛋白的表達(dá)，在促進(jìn)上皮細(xì)胞惡變及在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起十分重要的作用，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

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