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        蚧蟲初孵若蟲采集、保存和玻片標(biāo)本制作1)

        2012-09-18 01:27:48趙杰軍王自力陳曉鳴
        關(guān)鍵詞:冰醋酸玻片蟲體

        趙杰軍 王自力 陳曉鳴

        (中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所,昆明,650224)

        蚧蟲屬半翅目(Hemiptera)蚧總科(Coccoidea)昆蟲的通稱,全世界報道蚧蟲有7364種[1],中國記錄有1155種[2]。蚧蟲的分類鑒定主要依據(jù)雌成蟲的形態(tài)特征,較少涉及初孵幼蟲的形態(tài)特征。初孵幼蟲形態(tài)特征種間存在差異,對于種的鑒定具有重要的分類參考價值[3]。此外,蚧蟲寄主植物選擇機理研究應(yīng)首先弄清楚初孵幼蟲觸角、足和口器等感受器官的形態(tài)與結(jié)構(gòu),因為成蟲期這些感受器官發(fā)生退化,不能真實地反映蚧蟲選擇寄主過程中涉及的感受器官的形態(tài)特征[4]。蚧蟲初孵幼蟲為微小昆蟲,體長不足1 mm,用解剖鏡僅能觀察清楚蟲體輪廓如體形、體色、蠟絲等外部形態(tài)特征,采用掃描電鏡觀察,首先必須制作玻片觀察清楚蟲體的形態(tài)特征,再用掃描電鏡進(jìn)行重點形態(tài)結(jié)構(gòu)分析。蚧蟲初孵幼蟲柔軟、體被蠟絲,借用成蟲制作方法容易引起蟲體變形,借用其它微小昆蟲(蚜蟲)的制作方法不能完全除蠟,因此,探討蚧蟲初孵幼蟲玻片制作技術(shù)依然具有重要的價值。筆者以白蠟蟲初孵幼蟲玻片標(biāo)本制作為例,旨在提供蚧蟲初孵幼蟲的保存和玻片標(biāo)本的制作方法,主要介紹新引入的蟲體轉(zhuǎn)移用具與使用方法,以供相關(guān)的研究人員參考與交流。

        1 標(biāo)本采集與保存

        蚧蟲成蟲通常采用70%酒精保存,酒精容易引起蟲體表皮皺縮,玻片標(biāo)本主要適用表皮結(jié)構(gòu)觀察研究,而皺縮的表皮又會影響整體觀察效果。白蠟蟲初孵幼蟲的保存引入植物材料常用的保存液FAA。由于初孵幼蟲蟲體柔軟,F(xiàn)AA的配方為50%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福爾馬林5 mL,并按固定液體積的5%加入甘油。FAA與酒精保存液差別在于加入冰醋酸提高了滲透速度,使蟲體快速固定不變形,甘油軟化硬化結(jié)構(gòu)確保蟲體不變形,并且FAA可以同時保存蚧蟲及其寄主植物。一般采用FAA固定標(biāo)本0.5~2.0 h,即可進(jìn)入玻片制片階段。

        在野外用剪刀取有蟲枝條或者葉片,若種蟲周圍有孵化的幼蟲,直接用毛筆掃蟲放入采集瓶;若種蟲周圍無孵化的幼蟲,則取有蟲寄主植物材料帶回室內(nèi),放入培養(yǎng)皿(底墊光滑白紙)培養(yǎng),待幼蟲孵化,用毛筆掃入標(biāo)本瓶。標(biāo)本采集完畢,在標(biāo)本瓶中加入蟲體體積20~30倍的保存液。蟲體固定一段時間后,更換保存液1~2次,室溫保存可達(dá)數(shù)年。

        2 玻片標(biāo)本的制作

        2.1 蟲體轉(zhuǎn)移工具

        顯微眼科鑷子:由于蟲體微小,用一般的鑷子夾取極為困難,若采用顯微眼科鑷子(頭寬0.1 cm)可以輕松將蟲子移動。用吸管取蟲雖操作方便,操作者不用訓(xùn)練就可以移動蟲體,但吸管吸取蟲體的同時常夾帶其它雜質(zhì),用顯微眼科鑷子夾取蟲體避免了吸管取蟲的缺點。

        轉(zhuǎn)移蟲袋:在制片過程中,操作者通常發(fā)現(xiàn)蟲體經(jīng)過KOH處理后,蟲體幾乎透明,用肉眼極難辨認(rèn),常規(guī)方法在蟲體清洗、染色和脫水等過程中容易將蟲體丟失,并且耗時,處理的標(biāo)本數(shù)量較少。若采用轉(zhuǎn)移蟲袋,可避免常規(guī)制片出現(xiàn)的問題,既節(jié)省時間,還適用于批量制作,更重要的是避免了每個制片環(huán)節(jié)挪動蟲體,較為完整地保存了蟲體的細(xì)微結(jié)構(gòu)特征。此外,轉(zhuǎn)移蟲袋減少制片過程中接觸KOH、酒精、冰醋酸和二甲苯等溶液,使制片過程更為安全。轉(zhuǎn)移蟲袋采用200目以上的尼龍紗布制作,200目紗布孔徑不超過74 μm。制作方法簡單,將紗布裁剪為8 cm×4 cm方塊,按圖1所示虛線折疊,用昆蟲針或曲別針扣邊即可制作成轉(zhuǎn)移蟲袋(圖2)。

        圖1 轉(zhuǎn)移蟲袋制作示意圖

        圖2 轉(zhuǎn)移蟲袋

        2.2 冰醋酸酒精混合脫水

        在脫水過程中,采用常規(guī)的系列酒精溶液脫水,蟲體出現(xiàn)硬化、破碎,不易獲得完整的標(biāo)本。若采用酒精和冰醋酸體積比1︰1的混合溶液進(jìn)行脫水,蟲體細(xì)微結(jié)構(gòu)特征保存完好,并有利于整姿。酒精和冰醋酸的混合溶液設(shè)置70%、85%、95%、100%4個梯度,每個梯度用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的酒精和冰醋酸混合配制而成。

        2.3 Euparal封片

        微小昆蟲用中性樹脂或加拿大樹膠封片不容易整姿。用Euparal膠封片,可支持顯微鏡下緩慢地整理蟲體附肢。此外,Euparal膠封存的標(biāo)本更為平整和透明。

        2.4 制作過程

        ①蟲體軟化與沖洗。用吸管吸取蟲子,放入轉(zhuǎn)移蟲袋,掛上標(biāo)簽,將轉(zhuǎn)移蟲袋浸泡在10%KOH溶液中,30~40℃水浴;當(dāng)蟲體發(fā)白,立刻投入蒸餾水(60℃)沖洗3~5次,每次5 min。②系列冰醋酸酒精混合液脫水。將轉(zhuǎn)移蟲袋放入系列冰醋酸酒精混合溶液中脫水,每處理3~5 min;蒸餾水沖洗。③1%酸性品紅染色。將沖洗完畢的轉(zhuǎn)移蟲袋,放入1%酸性品紅染液中,染色時間控制在30~90 min;待肉眼觀察到蟲體發(fā)紅即可。④100%冰醋酸酒精混合液清洗脫水。將染色的轉(zhuǎn)移蟲袋直接放入冰醋酸酒精體積比1∶1混合溶液洗脫1~2 min,重復(fù)2次。⑤丁香油透明。打開轉(zhuǎn)移蟲袋,用吸管吸取丁香油緩慢沖洗袋子將蟲子洗脫于小培養(yǎng)皿或稱量皿,透明處理2~3 h后,開始封片。⑥整姿封片。取載玻片,在玻片中央部位滴1滴Euparal膠。在解剖鏡下,用顯微眼科鑷子夾取完整透明的蟲體放在載玻片上,轉(zhuǎn)移到100倍顯微鏡下,用超微針整理蟲體足和觸角,用一根超微針輕輕壓住蟲體,另一根針撥動附肢即可進(jìn)行整姿。取蓋玻片對準(zhǔn)蟲體接觸Euparal膠后,立刻松開手指,使蓋玻片自然沉降到蟲體身上,注意不可擠壓蓋玻片,以免壓碎蟲體。按照該方法制作的白蠟蟲初孵若蟲玻片標(biāo)本見圖3。

        圖3 白蠟蟲初孵若蟲玻片標(biāo)本

        3 結(jié)論與討論

        白蠟蟲初孵幼蟲玻片制作與其它微小昆蟲制片方法基本一致,僅在保存液、脫水溶液、封片劑以及轉(zhuǎn)移工具和軟化處理條件等方面進(jìn)行了改進(jìn),因此,白蠟蟲初孵幼蟲玻片標(biāo)本的制作方法同樣適用于其它一些微小昆蟲的玻片制作。

        蟲體軟化是制作優(yōu)質(zhì)玻片的首要環(huán)節(jié)。用KOH軟化蟲子除內(nèi)臟時,水浴溫度不宜過高,控制在30℃為宜。當(dāng)蟲體發(fā)白時,立刻移入蒸餾水(60℃)清洗2~3次。對于體長小于0.5 mm的小型昆蟲,用超微針穿刺蟲體除內(nèi)臟,即使在100倍解剖鏡也很難準(zhǔn)確定位穿刺部位。因此,微小昆蟲除內(nèi)臟建議用KOH稀溶液水浴溶解法。脫水是制片過程中重要的中間環(huán)節(jié)。采用冰醋酸或酒精單一脫水溶劑處理獲得標(biāo)本不完整。若將冰醋酸酒精對半混合脫水處理的標(biāo)本較為完整。蟲體整姿、封片是微小昆蟲制片操作最為困難的環(huán)節(jié)。微小昆蟲必須在高倍顯微鏡下進(jìn)行整姿。整姿完畢后,用Euparal膠封片較少出現(xiàn)蟲體皺縮和氣泡。

        在制片過程中,用轉(zhuǎn)移工具轉(zhuǎn)移蟲體使得蟲體的移動變得更為簡便、快捷。通常采用挑蟲環(huán)、挖耳和吸管等工具轉(zhuǎn)移蟲體[5-9]。挑蟲環(huán)可能適用于相對較大的蟲體,并且需要練習(xí),否則在溶液中挑蟲是困難的。吸管容易移動蟲體,但同時夾帶雜質(zhì)。此外,微小昆蟲通常將少量的蟲體放在玻片上進(jìn)行脫水、染色和透明,操作者眼睛必須隨時盯住蟲體,否則蟲體在換溶液時易丟失。蟲體軟化后蟲體外骨骼透明,操作者憑肉眼幾乎無法辨認(rèn)蟲體位置。微小昆蟲制片使用轉(zhuǎn)移蟲袋可以解決常規(guī)制片存在的問題。

        玻片標(biāo)本制作的安全性,逐漸受到了關(guān)注[6]。二甲苯透明標(biāo)本具有速度快、透明性好的特點,其副作用也明顯,建議使用丁香油代替二甲苯。昆蟲表皮屬于幾丁質(zhì),以酸性品紅對幾丁質(zhì)的染色效果突出,所以在昆蟲玻片制作上應(yīng)廣泛使用酸性品紅。對于酸性品紅致癌性較少有人關(guān)注,酸性品紅滲透速度快,在染色過程中必須戴手套。

        總之,微小昆蟲擬采用的制片方法必須確保獲得的玻片標(biāo)本清晰、潔凈和完整,操作簡單易行,對人體安全無毒副作用。

        [1]Ben-Dov Y.A systematic catalogue of eight scale insect families(Hemiptera:Coccoidea)of the world Aclerdidae,Asterolecaniidae,Beesoniidae,arayonemidae, Conchaspididae, Dactylopiidae,Kerriidae and Lecanodiaspididae[M].Amesterdam:Elsevier,2006.

        [2]湯祊德.我國蚧蟲研究的歷史、現(xiàn)狀和展望[J].武夷科學(xué),2001,17(1):82-86.

        [3]Cook L G,Gullan P J,Stewart A C.First-instar morphology and sexual dimorphism in the gall-inducing scale insect Apiomorpha Rübsaamen(Hemiptera:Coccoidea:Eriococcidae)[J].Journal of Natural History,2000,34:879-894.

        [4]Koteja J.On the phylogeny and classification of the scale insects(Homoptera,Coccinea)(discussion based on the morphology of the mouthparts)[J].Acta Zool Cracoviensia,1974,19:267-325.

        [5]王子清.中國動物志昆蟲綱:第22卷[M].北京:科學(xué)出版社,2001:261-270.

        [6]付海濱,王有福,王耀,等.植物檢疫性蚧蟲玻片標(biāo)本制作技術(shù)[J].植物檢疫,2009,23(3):30-31.

        [7]喬魯芹,張小娣.粉虱玻片標(biāo)本制作方法的改進(jìn)[J].昆蟲知識,1997,34(5):309.

        [8]張宏瑞,Okajima S,Mound L A.薊馬采集和玻片標(biāo)本的制作[J].昆蟲知識,2006,43(5):725-728.

        [9]高占林,李耀發(fā),黨志紅,等.蚜蟲玻片標(biāo)本的制作方法與技巧[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,13(3):159,168.

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