王 非 孫赟璐

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

李在善

(韓國(guó)江原大學(xué)山林環(huán)境科學(xué)學(xué)院)

李玉花 李風(fēng)日 李成德 由香玲

(東北林業(yè)大學(xué))

文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge)又名木瓜、文燈果等，屬無(wú)患子科文冠果屬，獨(dú)屬獨(dú)種。文冠果不僅樹形美觀，而且種子含油量達(dá)30% ～60%，是北方優(yōu)良的觀賞兼木本油料樹種［1］。與其他果樹相比，文冠果組織培養(yǎng)再生植株較困難。盡管研究者進(jìn)行了大量研究工作［2-4］，但目前文冠果的組織培養(yǎng)技術(shù)仍處于初級(jí)水平［1］，還有大量問題需要解決。芽芽繁殖是最能保持母本優(yōu)良特性的一種無(wú)性繁殖方式。早在1980年，張桂琴等以文冠果嫩莖為材料誘導(dǎo)出了腋芽，提出了其最適離體培養(yǎng)條件［5］。此后，王永明等、王玉珍等也提出了以文冠果側(cè)芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)條件［6-7］。然而他們對(duì)外植體材料的接種時(shí)期幾乎沒有闡述，僅大致描述了材料的狀態(tài)，如，張桂琴等僅描述了3～7年生的嫩莖和半木質(zhì)化枝條，王永明等也只說到利用帶腋芽的嫩莖段為外植體。這致使他們的研究結(jié)論差異較大，也限制了這些結(jié)論的實(shí)際應(yīng)用。筆者在上述研究的基礎(chǔ)上，主要探討組織培養(yǎng)不同取材時(shí)間的外植體芽(頂芽和腋芽)的啟動(dòng)和生長(zhǎng)情況，確定相對(duì)準(zhǔn)確的芽培養(yǎng)取材時(shí)間和狀態(tài)，從而為文冠果芽培養(yǎng)技術(shù)的完善提供一部分內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料來源及取材時(shí)間

本研究所用材料來自于黑龍江省安達(dá)市人民公園內(nèi)的約7～10年生文冠果優(yōu)樹。2010年分別于5月10日、6月10日、7月10日取材。5月10日，由于氣溫較低，新枝還未抽出，所取外植體為頂芽。6月10和7月10日，所取材料為新抽嫩枝的腋芽。

1.2 頂芽和腋芽的萌發(fā)接種

外植體消毒:對(duì)所取外植體，即文冠果包含頂芽的主枝(長(zhǎng)度約為2 cm)及新抽枝條進(jìn)行同樣的消毒處理。先放在飽和洗衣粉水溶液中沖洗，用流水沖洗2～3 h后置于超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗 3次，再用 5%次氯酸鈉(HClO3)溶液消毒15～20 min，無(wú)菌水沖洗3次，倒在無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)(墊有無(wú)菌濾紙)，準(zhǔn)備接種。

外植體接種:對(duì)頂芽外植體，首先剪去主枝，剝?nèi)ロ斞客獠亏[片和小葉，取出小芽接種在含有3%蔗糖和不同質(zhì)量濃度BA(0～2.0 mg/L)和NAA(0～0.5 mg/L)的MS培養(yǎng)基中光培養(yǎng)誘導(dǎo)頂芽萌發(fā)。對(duì)腋芽外植體，將其切成1.0～1.5 cm長(zhǎng)的莖段，接種于含有不同質(zhì)量濃度BA和NAA培養(yǎng)基中光培養(yǎng)誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。

每個(gè)含有約40 mL培養(yǎng)基的100 mL容量玻璃三角瓶中接種3、4個(gè)上述外植體，不同BA和NAA質(zhì)量濃度組合處理接種30瓶。

芽萌發(fā)數(shù)據(jù)用SPSS1310統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性多重(Duncan)分析。

1.3 萌發(fā)芽的繼代培養(yǎng)

頂芽或腋芽萌發(fā)后，將其切下繼代在萌發(fā)較好的培養(yǎng)基中，觀察并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)芽的生長(zhǎng)情況。

1.4 萌發(fā)芽的生根

選取上述生長(zhǎng)較整齊一致的芽，切取2.5 cm，接種在含 IBA(0.4 ～ 1.0 mg/L)、NAA(0.2 ～ 0.4 mg/L)和2%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。4周后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.5 培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)所用培養(yǎng)均調(diào)整pH值為5.8后，在121℃、1.0～1.5個(gè)大氣壓之間滅菌15 min后用于接種。培養(yǎng)室的溫度為(23±2)℃，光照由白色日光燈提供，光照時(shí)間為白天16h，晚上8h，光照強(qiáng)度為1500～2000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取材時(shí)間對(duì)芽萌發(fā)的影響

5月10日由于東北的氣溫較低，頂芽還未萌發(fā)(如圖1A)。接種過程發(fā)現(xiàn)所取材料中有約60%頂芽是花芽(圖1B箭頭所示)。因此，該時(shí)期取材會(huì)對(duì)文冠果未來的果實(shí)造成不利影響。6月10日和7月10日接種的腋芽，在培養(yǎng)過程中都發(fā)現(xiàn)了一個(gè)顯著的特點(diǎn)，即大約7～10 d，在接種的葉柄基部(如圖1F、圖1G中箭頭所示)接種的腋芽萌發(fā)較快。

培養(yǎng)3周后，統(tǒng)計(jì)3個(gè)取材時(shí)間頂芽、腋芽的萌發(fā)情況(如表1)。可以看出5月10日(圖1B、圖1C)和6月10日(圖1D、圖1E)取材的頂芽和腋芽在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用下都有不同程度的萌發(fā)，而7月10日所取材都沒有萌發(fā)(如圖1G、圖1H)。5月份取材比6月份取材，芽的萌發(fā)率更高。同時(shí)，芽的萌發(fā)與培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和質(zhì)量濃度有關(guān)，5月份取材的外植體在BA0.1 mg/L和 BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L 的條件下，芽的萌發(fā)率分別為88.4%和88.2%，相差不顯著;但萌發(fā)芽的生長(zhǎng)狀況差異顯著，分別為2.5和2.0 cm。6月份取材的外植體在BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L的條件下，芽的萌發(fā)率相對(duì)比其他植物生長(zhǎng)素條件下的高，約51.3%，萌發(fā)芽高為1.5 cm。

圖1 不同時(shí)期所取文冠果芽的萌發(fā)、生長(zhǎng)及生根

2.2 萌發(fā)芽的繼代

上述萌發(fā)芽切割下來，按照月份接種到含有BA和NAA的培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，芽切割下來很容易玻璃化，繼而死亡。培養(yǎng)4周后的繼代萌發(fā)芽的存活率統(tǒng)計(jì)如表2?？梢?，5、6月份取材獲得的芽主要在兩種培養(yǎng)條件下(BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L，BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L)能存活下來，分別為:70.3%，27.5%，69.5%，20.8%，芽的存活率相差不大;繼代較好的培養(yǎng)基條件為BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L。

表1 不同時(shí)期所取外植體在含有不同質(zhì)量濃度BA和NAA的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后的萌發(fā)

表2 不同時(shí)間取材萌發(fā)芽繼代培養(yǎng)4周的存活情況

2.3 萌發(fā)芽的生根

將萌發(fā)芽接種到含有IBA和NAA的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。培養(yǎng)4周后的生根情況統(tǒng)計(jì)如表3?？梢?，生根率都不高，最高的為24%，其培養(yǎng)條件為 IBA0.8 mg/L+NAA0.4 mg/L。

文冠果生根較困難，本研究中文冠果生根的幾種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比是查閱了相關(guān)的資料確定的。其中關(guān)于IBA1.0 mg/L主要參考了王永明等提出的誘導(dǎo)文冠果生根的培養(yǎng)基條件(MS大量元素減半，附加IBA1.0mg/L、蔗糖1.5% 、瓊脂均為0.8%，pH 值為 5.8 ～ 6.2［6］，但并未獲得理想的結(jié)果，生根率只有12%，可能由不定芽的狀態(tài)、試驗(yàn)條件的差異引起的。本研究中的其他生根條件主要來自程冉試驗(yàn)提出的文冠果生根最佳培養(yǎng)基(MS+IAA1.0 ～ 2.0 mg/L)［8］，但生根率都不高。其他獲得理想生根的還有張桂琴等和王玉珍等的研究結(jié)果。張桂琴等經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究提出文冠果生根的最佳培養(yǎng)基是在 SH培養(yǎng)基上附加 IBA1.5 mg/L、IAA1.0 mg/L，或在MS培養(yǎng)基上附加H培養(yǎng)基的葉酸、生物素等［5］。在轉(zhuǎn)接之前，先將小苗基部切口以上0.3 cm處在酒精I(xiàn)BA溶液(用95%酒精配制成含0.1%IBA的溶液)中速浸幾秒鐘。經(jīng)約半個(gè)月根即伸長(zhǎng);根系粗壯，側(cè)根多，發(fā)根率能達(dá)83%。王玉珍等在文冠果組培快繁專利中提出的文冠果最佳生根培養(yǎng)基為:在1/2 MS培養(yǎng)基中添加 IBA0.25～2.0 mg/L，NAA0.5 ～3.0 mg/L，AC0.5 ～ 1.0 mg/L，食用糖15～20 g/L［2］。由于組織培養(yǎng)過程中其他一些微環(huán)境和個(gè)人操作的差異，同樣研究?jī)?nèi)容在不同的實(shí)驗(yàn)室、同一實(shí)驗(yàn)室不同操作人之間的結(jié)果往往差異很大。由于本試驗(yàn)的材料有限，報(bào)道的一些理想生根條件還需要進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

表3 芽在含有IBA和NAA的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周的生根情況

3 討論

組織培養(yǎng)中外植體狀態(tài)是培養(yǎng)成敗的最關(guān)鍵因素。腋芽和頂芽是離體無(wú)性繁殖經(jīng)常利用的一種材料，由于室外的季節(jié)和溫度變化，適合組織培養(yǎng)的芽的狀態(tài)應(yīng)該是在春天芽開始萌動(dòng)和剛剛萌發(fā)的時(shí)候，研究結(jié)果也顯示了頂芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在5月初，哈爾濱地區(qū)氣溫已經(jīng)開始升高，文冠果樹木開始萌發(fā)，應(yīng)該是取材的最佳時(shí)期。但由于文冠果頂芽中有很大一部分是花芽，而此時(shí)從外觀上無(wú)法區(qū)分花芽和腋芽，考慮到此時(shí)取材會(huì)對(duì)母樹起破壞作用，所以不建議該時(shí)期取材。6、7月份進(jìn)行的研究，材料都是半木質(zhì)化的嫩莖，但腋芽萌發(fā)差異顯著，可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，半木質(zhì)化程度、次生物質(zhì)的積累等存在差異。

對(duì)于腋芽的繼代和增殖，到目前還沒有查到理想結(jié)果的報(bào)道，僅嘗試了其繼代培養(yǎng)的條件，其高效增殖還需進(jìn)一步研究。

［1］張娜，郭進(jìn)平.文冠果組織培養(yǎng)技術(shù)關(guān)鍵環(huán)節(jié)研究進(jìn)展與展望［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通訊，2009，25(8):113-116

［2］顧玉紅，高述民，郭惠紅，等.文冠果的體細(xì)胞胚發(fā)生［J］.植物生理學(xué)通訊，2004，40(3):311-313.

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［7］王玉珍，李霞，張弛.文冠果組培快速繁殖方法:中國(guó)，10103226［P］.2007-9-12.

［8］程冉.文冠果的引種、快繁及優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)栽培技術(shù)體系研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004:31-32.