逄 越，龔興旺，黃金莎，李慶偉,*

（1. 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2. 遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧 大連 116029）

日本七鰓鰻(Lampetra japonica)是現(xiàn)存最古老的脊椎動(dòng)物代表。由于七鰓鰻是聯(lián)系無(wú)脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物之間的重要階元，因此在遺傳信息方面，它必定印記了無(wú)脊椎動(dòng)物的進(jìn)化歷史，同時(shí)作為脊椎動(dòng)物最直接的祖先，又為脊椎動(dòng)物的起源與進(jìn)化提供豐富的遺傳信息[1-3]。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是一種相對(duì)分子質(zhì)量為36KD的酸性蛋白，已經(jīng)證實(shí)它的表達(dá)是同細(xì)胞周期中S期的細(xì)胞增殖狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，直接參與 DNA的合成和復(fù)制，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的特異性核抗原[4.5]。1987年 Bravo等[6]指出PCNA是DNA多聚酶δ的輔助蛋白，DNA合成必不可少的因子，PCNA在細(xì)胞核內(nèi)合成，并存在于細(xì)胞核內(nèi)。PCNA在細(xì)胞周期的不同階段表達(dá)有所不同，在G0～G1期細(xì)胞中無(wú)明顯表達(dá)，G1晚期，其表達(dá)大幅度增加，S期達(dá)到高峰，G2～M期明顯下降，其量的變化與DNA合成一致。因而檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá)，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)[7-9]。本研究首次獲得七鰓鰻pcna基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。除此之外，建立七鰓鰻PCNA與綠色熒光蛋白融合基因表達(dá)載體并成功表達(dá)融合蛋白。七鰓鰻pcna基因真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建及表達(dá)為pcna基因在七鰓鰻中生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)，也為七鰓鰻細(xì)胞株建立提供材料。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料：日本七鰓鰻2011年12月末采自黑龍江省松花江流域同江地區(qū)。選取健康、體表完整的個(gè)體，經(jīng)過(guò) 7d培養(yǎng)觀察，證實(shí)無(wú)病后用于實(shí)驗(yàn)。

菌株與質(zhì)粒：質(zhì)粒PGFP-N2、大腸桿菌DH5α菌株、Hela細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、T4DNA連接酶、pMD19-T Simple Vector、PrimeScript RT-PCR Kit、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(Agarose GeI DNA Purification Kit)、質(zhì)粒小量提取試劑盒和DL2000、DL5000DNA 和 λ-HindⅢdigest DNA Marker均購(gòu)自大連TaKaRa公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Xfect Transfection Reagent購(gòu)自Clontech公司；DMEM高糖、FBS、DPBS、卡那霉素、Typan blue購(gòu)自于 Hyclone公司；Sodium Pyruvate購(gòu)自 Invitrogen公司；Trypsin-EDTA Solution購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 功能基因的EST比對(duì)及序列進(jìn)化分析

從本實(shí)驗(yàn)前期構(gòu)建的七鰓鰻肝臟cDNA文庫(kù)(2.1×106pfu/mL)中隨機(jī)挑選cDNA單克隆進(jìn)行表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)測(cè)序，建立EST數(shù)據(jù)庫(kù)(約10077條EST序列)[10]。將EST序列在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(SwissProt, GenBank, PDB)中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)一條與高等脊椎動(dòng)物 pcna基因同源的序列。利用CLUSTAL X軟件(version 1.81)將七鰓鰻PCNA氨基酸序列同其它不同物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA(version 4.0)軟件做進(jìn)化樹分析。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成

取 50～100 mg七鰓鰻肝臟組織按照 Trizol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，置于-80℃冰箱保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PrimeScript RT-PCR Kit(Code No：DRR014S)說(shuō)明書操作進(jìn)行，以適量總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)為引物，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系于30℃溫育10 min；42℃溫預(yù)30 min；95℃溫育5 min。最終獲得cDNA第一鏈。

1.2.3 Lj-pcna基因片段擴(kuò)增

參考七鰓鰻肝臟cDNA文庫(kù)中的EST序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)如下引物，P1F：5'-ACACACGACAAACGCACTCGCCAA-3'，P1R：5'-TTATGCAGCCTCTTCATCCTC-3'。以含有pcna全長(zhǎng)基因的日本七鰓鰻第一鏈cDNA為模板，使用 PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Code No：DR010S)擴(kuò)增Lj-pcna基因。反應(yīng)條件：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min。取出PCR產(chǎn)物10 mg/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像分析系統(tǒng)記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 Lj-pcna基因克隆

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No：DV805A)切膠回收PCR產(chǎn)物。將目的片段 Lj-pcna與 pMD19-T Simple Vector(Code No：D104A)連接，并導(dǎo)入大腸埃希菌 DH5α感受態(tài)菌中，提取重組質(zhì)粒 T-Lj-pcna送到大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序及序列分析。

1.2.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以T-Lj-pcna重組質(zhì)粒為模板，根據(jù)1.2.4所測(cè)序列設(shè)計(jì)如下引物，P2F：5'-CCCAAGCTT ATGTTCGAGGCACGCATCCT G-3',P2R:5'-CGCGGATCCTGCAGCCTCTTCATC CTCAAT-3'。在上下游引物序列中分別添加了HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。PCR擴(kuò)增步驟如1.2.3所示?；厥盏腜CR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體分別用HindⅢ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切的Lj-pcna基因片段和質(zhì)粒PGFP-N2片段通過(guò)T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌 DH5a感受態(tài)中，在含有 kanar抗生素（20 ug/mL）的LB固體培養(yǎng)基上篩選確認(rèn)陽(yáng)性克隆菌。挑取陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)而提取PGFP-N2-Lj-pcna重組質(zhì)粒，送至寶生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序及序列分析。

1.2.6 重組質(zhì)粒pGFP-N2-Lj-pcna轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞

用高糖 DMEM（含10% FBS）培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24 h，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、細(xì)胞密度約70%的細(xì)胞接種12-well plate，去掉細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，使用5 mL DPBS清洗，去掉培養(yǎng)基后添加 1 mL Trypsin-EDTA Solution，37℃放置，待細(xì)胞完全消化；再添加 9mL新鮮培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，添加Typan blue計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105cells/mL，0.5 mL/well 在12-well plate中接種細(xì)胞；37 5% CO2℃ 條件下培養(yǎng)24 h；24 h后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞密度約70%，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：使用Xfect Transfection Reagent (Clontech cat#631317)，準(zhǔn)備2個(gè)1.5 mL tube，分別命名為Polymer和DNA，按如下方法添加試劑：DNA tube: 5uL PGFP-N2-Lj-pcna Plasmid (500 ng/uL) + 45 uL Xfect Reaction Buffer Polymer tube: 0.75 uL Xfect Polymer + 49.25 uL Xfect Reaction Buffer 分別震蕩混勻，之后將 Polymer tube的混合液添加到DNA tube中，中速震蕩混勻10 s，混合液室溫下放置15 min，之后將100 uL的混合液全量添加到細(xì)胞孔中，100 uL/well，前后左右搖蕩 12-well plate混勻，37℃放置培養(yǎng)4 h后，細(xì)胞孔中使用1mL 新鮮培養(yǎng)基換液，繼續(xù) 37℃培養(yǎng)24 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 Lj-pcna片段擴(kuò)增結(jié)果

從日本七鰓鰻肝臟組織中獲得 pcna基因，PCR產(chǎn)物經(jīng) 10 mg/L瓊脂糖凝膠電泳，在大約800bp處可見特異性擴(kuò)增條帶，見圖1。

2.2 七鰓鰻PCNA生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI網(wǎng)站ORF搜索軟件分析Lj-pcna cDNA序列786bp，編碼261個(gè)氨基酸，蛋白分子量為28713Da，見圖2所示。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得多個(gè)物種的PCNA氨基酸序列，構(gòu)建進(jìn)化樹（如圖3），結(jié)果顯示，日本七鰓鰻PCNA基因位于脊椎動(dòng)物PCNA基因的外群，且處于節(jié)肢動(dòng)物門、尾索動(dòng)物亞門及脊椎動(dòng)物亞門之間，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

圖1 Lj-pcna目的基因

圖2 日本七鰓鰻 pcna的 ORF區(qū)及其編碼的氨基酸序列

圖3 PCNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 構(gòu)建pGFP-N2-Lj-pcna真核表達(dá)載體

將帶酶切位點(diǎn)的 Lj-pcna目的片段和pGFP-N2質(zhì)粒均用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，切膠回收后分別用10 mg/L的瓊脂糖凝膠鑒定，見圖 4。用 T4連接酶將切膠回收后的目的片段Lj-pcna與 pGFP-N2載體連接，轉(zhuǎn)化，提取pGFP-N2-Lj-pcna重組質(zhì)粒。

圖4 pGFP-N2載體及Lj-pcna酶切片段回收

2.4 真核表達(dá)載體鑒定

pGFP-N2-Lj-pcna重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切及PCR擴(kuò)增均得到約780bp的目的片段，見圖5，測(cè)序結(jié)果顯示插入載體中的pcna核苷酸序列沒(méi)有發(fā)生突變，與cDNA文庫(kù)中EST序列完全一致，說(shuō)明成功將 pcna基因構(gòu)建到pGFP-N2真核表達(dá)載體中。

圖5 真核表達(dá)載體pGFP-N2-Lj-pcna鑒定

2.5 pGFP-N2-Lj-pcna在Hela細(xì)胞中表達(dá)

在12-well plate 中接種 Hela 細(xì)胞，細(xì)胞接種后 24 h，使用 Xfect Transfection Reagent將pGFP-N2-Lj-pcna質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光蛋白表達(dá)，見圖6。

圖6 融合蛋白（七鰓鰻PCNA和綠色熒光蛋白）在Hela細(xì)胞中表達(dá)(×100)

3 討論

pcna又稱為周期蛋白(Cyclin)，是DNA多聚酶 δ 的一種輔助因子。靜止細(xì)胞含量很少，G1晚期開始增多，S期達(dá)到高峰，G2期、M期下降，其量的變化與DNA合成一致，腫瘤細(xì)胞增殖越活躍，pcna表達(dá)越高，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)[11-14]。七鰓鰻是現(xiàn)存最原始的無(wú)頜類脊椎動(dòng)物，它印記了無(wú)脊椎動(dòng)物的進(jìn)化歷史，同時(shí)作為脊椎動(dòng)物最直接的祖先，又為脊椎動(dòng)物的起源與進(jìn)化提供了豐富的遺傳信息。七鰓鰻作為脊椎動(dòng)物發(fā)育早期和原始特征的模型，是研究哺乳動(dòng)物基因起源和進(jìn)化十分難得的實(shí)驗(yàn)材料。前期研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的七鰓鰻細(xì)胞分裂緩慢，細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，不利于體外七鰓鰻組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)，更難以建立七鰓鰻細(xì)胞系[15]。因此促使我們從cDNA文庫(kù)的EST序列中尋找促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的一些周期蛋白，其中pcna基因就是一個(gè)重要的細(xì)胞周期蛋白。目前，還沒(méi)有關(guān)于七鰓鰻pcna基因序列與功能的相關(guān)報(bào)道。本課題組首次從日本七鰓鰻肝臟組織中克隆了與高等脊椎動(dòng)物 pcna同源的cDNA序列。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST搜索分析表明，七鰓鰻 pcna的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列和其他物種的 pcna有很高的同源性。從進(jìn)化樹結(jié)果分析，Lj-pcna位于高等脊椎動(dòng)物pcna基因的外群。因此可通過(guò)對(duì)日本七鰓鰻（現(xiàn)存最古老的脊椎動(dòng)物）pcna基因的研究，從而確定七鰓鰻與其它物種的進(jìn)化地位及聯(lián)系。

目前用于表達(dá)外源性基因的真核表達(dá)載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。一般而言，病毒載體相對(duì)表達(dá)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率高，不過(guò)易隨機(jī)整合到靶細(xì)胞的染色體上，故難以控制且安全性差。非病毒載體主要是質(zhì)粒載體，質(zhì)粒載體被轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞后，獨(dú)立存在于靶細(xì)胞中，對(duì)靶細(xì)胞自身傷害小，安全性較好，因此本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)粒載體作為目的基因的攜帶者，將目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞中。近幾年來(lái)，報(bào)告基因已普遍應(yīng)用在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域[16]，現(xiàn)有報(bào)告基因種類很多，如半乳糖苷酶(LacZ)、葡萄糖苷酸酶(GUS)、螢火蟲熒光素酶(LUC)等，此外，綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是一類較理想的報(bào)告基因，其在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域及臨床檢測(cè)中都發(fā)揮著重要作用，將帶有GFP報(bào)告基因的載體轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞后，可以很方便地觀察目的蛋白的定位及確定目的蛋白在細(xì)胞或體內(nèi)的表達(dá)情況，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過(guò)熒光顯微鏡可以對(duì)表達(dá) GFP的細(xì)胞進(jìn)行定位觀察。目前科研領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的是將GFP同目的蛋白形成融合蛋白，通過(guò)GFP熒光顯示位置從而監(jiān)測(cè)目的蛋白的定位[17]，由于GFP作為報(bào)告基因具有方便、及時(shí)、直觀、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)，因而在基因表達(dá)、基因整合、細(xì)胞分選及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究領(lǐng)域的應(yīng)用是其它報(bào)告基因所無(wú)法取代的[18.19]。因此本實(shí)驗(yàn)采用分子克隆技術(shù)，將七鰓鰻pcna基因構(gòu)建到pGFP-N2真核表達(dá)載體上，經(jīng)限制性酶切，PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序等證明載體構(gòu)建成功。另外應(yīng)用一種新型的轉(zhuǎn)染試劑——Xfect，一種用于胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Xfect轉(zhuǎn)染試劑兼容性很好，無(wú)論質(zhì)粒質(zhì)量好壞，也無(wú)論質(zhì)粒是環(huán)狀還是線性，均能獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pcna蛋白與綠色熒光蛋白以融合蛋白形式表達(dá)在Hela細(xì)胞內(nèi)，且表達(dá)效率較高。

本研究成功將七鰓鰻 pcna基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體 pGFP-N2上，并在 Hela細(xì)胞中成功地表達(dá)了PCNA和GFP融合蛋白，說(shuō)明我們構(gòu)建的針對(duì) pcna的真核表達(dá)載體是正確有效的，為后續(xù)研究 pcna基因在七鰓鰻中功能研究以及同其它基因之間的相互關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)工具，并為今后能夠建立穩(wěn)定的七鰓鰻細(xì)胞株奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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