王春燕 杜江 吳森林 孫愛華

gyrA和parC基因突變與解脲支原體喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)性研究

王春燕 杜江 吳森林 孫愛華

目的探討解脲支原體gyrA和parC基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)突變與喹諾酮類藥物耐藥的相關(guān)性。方法用支原體培養(yǎng)、鑒定和藥敏一體化試劑盒分離獲得42株解脲支原體并檢測對3種喹諾酮類藥物的耐藥性，同時PCR法擴增臨床分離株的gyrA和parC基因喹諾酮耐藥決定區(qū)并進(jìn)行測序分析。結(jié)果對3種喹諾酮均敏感1株，41株至少對1種藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥。gyrA和parC基因喹諾酮耐藥決定區(qū)測序發(fā)現(xiàn)上述敏感株和1株耐藥株不發(fā)生突變，其余40株耐藥株gyrA和parC基因發(fā)生D112E和(或)S83L突變。結(jié)論3種喹諾酮類藥物耐藥均較嚴(yán)重，已不適合作為臨床推薦用藥，解脲支原體gyrA和parC基因喹諾酮耐藥決定區(qū)突變與耐藥密切相關(guān)。

解脲支原體gyrA和parC基因突變序列分析耐藥性

材料與方法

1．菌株的來源:2007年11月～2010年11月上海市東方醫(yī)院性病皮膚病門診擬診斷為非淋性尿道炎病人泌尿生殖道分泌物。女性患者取宮頸分泌物，先用無菌棉簽拭去宮頸分泌物，然而用新的無菌棉拭子插入宮頸1～2cm旋轉(zhuǎn)360°后停留30s，取柱狀上皮細(xì)胞;男性患者禁尿2h以上用無菌細(xì)小棉拭子緩慢插入尿道2～4cm處，捻轉(zhuǎn)1周并停留30s后取柱狀上皮細(xì)胞標(biāo)本。血清3型解脲支原體標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 700970來自浙江大學(xué)病原生物系。

2．支原體分離與鑒定及藥敏試驗:支原體鑒定及藥敏試驗一體化試劑盒由珠海黑馬生物工程公司生產(chǎn)，將取樣棉拭子進(jìn)行洗脫，按試劑盒說明書操作，與生長對照孔比較，培養(yǎng)24h后UU孔由黃色變?yōu)槌壬蚣t色且未見渾濁為陽性，表示有UU生長，不變色表示陰性。篩選獲得的42株解脲支原體菌株，－70℃保存。

3．藥敏試驗結(jié)果判斷:支原體鑒定藥物環(huán)丙沙星、氧氟沙星和司帕沙星3種藥物高、低兩個濃度各設(shè)1孔，根據(jù)支原體鑒定及藥敏試驗一體化試劑盒操作及結(jié)果判斷說明，兩孔均不變色表示敏感，都變紅色表示耐藥，低濃度孔變紅色，高濃度孔不變色表示中介。

4．DNA模板的制備:采用申能博彩(BioColor)生物有限公司提供的DNA提純試劑盒制備DNA模板，具體步驟如下:取耐藥菌株培養(yǎng)物500μl，10000r/min離心10min，沉淀中加入25μl細(xì)菌裂解液，充分混勻后沸水浴10min，13000r/min離心10min取5μl上清作為PCR的DNA模板。

5．引物設(shè)計:參考GenBank登錄血清3型解脲支原體gyrA和parC基因參考序列(Genbank:AF222894．1)及QRDR位置設(shè)計上、下游引物。gyrA基因上游引物序列:5'－GGA ATG ACA CAT GAT AAG CC－3'，下游引物序列:5'－TTC TGA TGC ATC ATA ATT AGG－3'。parC基因上游引物序列:5'－TAC GCA ATG AGT GAA TTA GGA－3'，下游引物序列:5'－ TGA TAA TCG AGC AAC TGT ATA－3'。委托上海生工生物技術(shù)有限公司(Sangon)合成引物。

5．PCR擴增及擴增產(chǎn)物檢測:PCR總體積為100μl，內(nèi)含2．5mol/L各dNTP、250nmol/L各引物、2．5U Ex－Taq DNA聚合酶(TaKaRa)、DNA模板5μl、1×PCR緩沖液(pH 8．3)。PCR參數(shù):94℃4min;94℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán);72℃5min。采用1μg/ml溴乙錠預(yù)染色的2．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，目的基因擴增片段預(yù)期大小分別為294bp和237bp，擴增產(chǎn)物包括gyrA和parC基因QRDR區(qū)域。

6．核苷酸序列測定及分析:采用BioColor公司的3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒提純，委托Sangon公司測定PCR純化產(chǎn)物gyrA和parC基因片段的核苷酸序列。參照已報道的血清3型解脲支原體標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 700970 gyrA和parC基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列進(jìn)行比較，以確定上述菌株gyrA和parC基因QRDR的突變情況。

結(jié)果

1．藥敏結(jié)果:42株解脲支原體對3種喹諾酮類藥物藥敏試驗結(jié)果見表1。除1株對3種喹諾酮類藥物均敏感外，其余41株至少對1種藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥。對環(huán)丙沙星耐藥和中介的分別有71.4% (30/42)和26．2%(11/42)，對氧氟沙星耐藥和中介分別有21．4%(9/42)和35．7%(15/42)，對司帕沙星的耐藥和中介的分別占23．8%(10/42)和31．0% (13/42)。

表1 解脲支原體對3種藥物的敏感性及gyrA和parC QRDR變異情況

2．PCR擴增結(jié)果:42株解脲支原體DNA都能用自行設(shè)計引物擴增出gyrA和parC基因目的片段，2.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示在294bp和237bp位置有g(shù)yrA和parC基因擴增的目的片段。同樣條件下血清3型解脲支原體標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 700970 PCR擴增結(jié)果為陽性(圖1、圖2)。

3．PCR測序結(jié)果:42株菌株gyrA和parC基因目的片段PCR測序結(jié)果與血清3型標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 700970對應(yīng)序列比較見表1，對3種喹諾酮類藥物均敏感菌株測定序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株完全相同。至少對1種喹諾酮類耐藥解脲支原體臨床菌株41株，gyrA和parC基因QRDR區(qū)核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC700970對應(yīng)區(qū)域?qū)Ρ?，發(fā)現(xiàn)gyrA基因存在12處堿基突變，但除336位堿基c突變?yōu)閍導(dǎo)致編碼氨基酸發(fā)生替換突變(D112E)外其余均為同義突變; parC基因也存在11處突變，其中248位堿基c突變?yōu)閠結(jié)果導(dǎo)致83位絲氨酸被亮氨酸替換(S83L)，其余10處堿基突變引起氨基酸同義突變。33號耐藥株gyrA和parC基因QRDR區(qū)均不發(fā)生突變，有4株只發(fā)生1個突變，其中3株耐藥株(31、34和41號) gyrA基因發(fā)生c336a(D112E)單突變，1株(32號) parC基因c248t(S83L)發(fā)生單突變。其余36株耐藥株均發(fā)生gyrA基因c336 a(D112E)和parC基因c248 t(S83L)雙突變。

討論

支原體感染導(dǎo)致的泌尿生殖道感染時有報道，其中又以解脲支原體檢出率最高。由于支原體沒有固定的細(xì)胞壁，部分針對細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素如β－內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感，喹諾酮類藥物是一類對支原體敏感的抗菌藥物，主要作用于支原體繁殖傳代中DNA的復(fù)制過程，通過抑制細(xì)菌DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性達(dá)到抗菌目的［5，6］。近年由于抗生素濫用和用藥不規(guī)范使支原體對喹諾酮類藥物出現(xiàn)耐藥，且不同地區(qū)報道耐藥率有較大差異常，因此研究本地區(qū)支原體對喹諾酮類藥物耐藥情況具有現(xiàn)實意義［3～5］。

喹諾酮類藥物耐藥主要機制作用靶酶的突變，國內(nèi)、外對大腸桿菌和淋病奈瑟菌喹諾酮類藥物耐藥與gyrA和parC基因突變位點集中發(fā)生在基因上的一段與喹諾酮類耐藥相關(guān)的QRDR區(qū)。其中最主要的是與gyrA和parC基因編碼蛋白GyrA和ParC空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的D112和S83氨基酸突變［3～6］。本研究發(fā)現(xiàn)對3種喹諾酮類藥物都敏感的菌株GyrA和ParC氨基酸編碼與解脲支原體血清3型標(biāo)準(zhǔn)株序列完全相同，有5株耐藥株GyrA或ParC氨基酸序列不發(fā)生突變或只發(fā)生單個突變，1株P(guān)arC氨基酸序列發(fā)生S83L替換突變，3株GyrA氨基酸發(fā)生D112E替換突變，上述4株菌株只對1種或2種喹諾酮類藥物產(chǎn)生中介耐藥，說明解脲支原體GyrA和ParC氨基酸序列突變發(fā)生率與耐藥程度有關(guān)，另有33號菌株對環(huán)丙沙星耐藥GyrA和ParC氨基酸序列與解脲支原體血清3型標(biāo)準(zhǔn)株序列完全相同，可能有不在檢測范圍與耐藥相關(guān)的突變存在或還有其他喹諾酮類藥物的耐藥機制存在。

解脲支原體的GyrA和ParC氨基酸序列存在D112E和S83L雙突變菌株有36株，占41株耐藥株的87．8%，提示GyrA和ParC氨基酸序列存在D112E和S83L雙突變與諾酮類藥物耐藥密切相關(guān)，此結(jié)果與2002年我國湖南張文波等［2］和2006年浙江謝鑫友等［4］報道相似，與2003年法國Bebear等［3］和2009年英國Beeton等［5］報道解脲支原體除存在與我們一致的D112E和S83L雙突變外尚有ParC氨基酸序列第125位或136位的蘇氨酸(Thr)替換丙氨酸(Ala)突變，提示解脲支原體gyrA和parC基因QRDR區(qū)與喹諾酮類耐藥相關(guān)的突變類型與分布存在區(qū)域性差異，檢測本地區(qū)解脲支原體gyrA和parC基因QRDR區(qū)點突變對于臨床治療藥物的選擇有參考價值。41株耐藥株中只有1株發(fā)生雙突變菌株對3種藥物都呈中介耐藥，其余35株至少對1種喹諾酮類藥物耐藥，耐藥程度高的菌株占97．2%。41株耐藥株中5株不存在突變或只發(fā)生單位點突變，其中只有1株對環(huán)丙沙星耐藥程度高呈耐藥，其余4株只呈現(xiàn)中介耐藥，耐藥程度高的菌株占20．0%。兩者比較有顯著性差異(P＜0．01)，提示GyrA和ParC氨基酸序列D112和S83突變發(fā)生與耐藥密切相關(guān)且突變數(shù)目與耐藥程度相關(guān)。

1Farkas B，Ostorházi E，Pónyai K，et al．Frequency and antibiotic resistance of ureaplasma urealyticum and mycoplasma hominis in genital samples of sexually active individuals［J］．Orv Hetil，2011，152(42): 1698－1702

2Zhang W，Wu Y，Yin W，et al．Study of isolation of fluoroquinoloneresistant ureaplasma urealyticum and identification of mutant sites［J］．Chin Med J，2002，115(10):1573－1575

3Bébéar CM，Renaudin H，Charron A，et al．DNA gyrase and topoisomerase IV mutations in clinical isolates of ureaplasma spp．a(chǎn)nd mycoplasma hominis resistant to fluoroquinolones［J］．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2003，47(10):3323－3325

4Xie X，Zhang J．Trends in the rates of resistance of ureaplasma urealyticum to antibiotics and identification of the mutation site in the quinolone resistance－determining region in Chinese patients［J］．FEMS Microbiol Lett，2006，259:181－186

5Beeton ML，Chalker VJ，Kotecha S，et al．Comparison of full gyrA，gyrB，parC and parE gene sequences between all ureaplasma parvum and ureaplasma urealyticum serovars to separate true fluoroquinolone antibiotic resistance mutations from non－resistance polymorphism［J］．J Antimicrob Chemother，2009，64(3):529－538

6Chen FJ，Lo HJ．Molecular mechanisms of fluoroquinolone resistance［J］．J Microbiol Immunol Infect，2003，36(1):1－9

(收稿:2012－01－16)

(修回:2012－02－20)

Correlation of Mutation Patterns in gyrA and parC Genes in Ureaplasma Urealyticum Isolates with Quinolones Resistance．

Wang Chunyan，Du Jiang，Wu Senlin，Sun Aihua．Department of Clinical Laboratory，Shanghai East Hospital，Shanghai 200120，China

ObjectiveTo analyze mutations in the quinolone－resistance－determining－region(QRDR)within genes of gyrA and parC patterns in gyrA and parC genes and quinolones resistance in ureaplasma urealyticum(Uu)isolates．MethodsMycoplasma detection kits were used to culture and identificate mycoplasma as well as drug sensitivity．PCR and DNA sequencing were conducted to analyze QRDR associated genes of gyrA and parC in 42 isolates．ResultsOnly 1 isolate susceptible to all quinolones．Fourty－one isolates showed varying degree resistance to at least one kind of quinolones．Sequencing analysis of gyrA and parC revealed that the susceptible isolate and 1 resistance isolate had no mutation，F(xiàn)ourty resistance isolates had mutation of D112E and/or S83L in GyrA and ParC．ConclusionThree quinolones should not be routine therapy for ureaplasma urealyticum infections．Mutations in gyrA and parC genes play an important role in the development of quinolones resistance in ureaplasma urealyticum．

Ureaplasma urealyticum;gyrA and parC genes;Mutation;Sequence analysis;Drug resistance

解脲支原體(ureaplasma urealyticum，UU)是引起泌尿生殖道感染的一種重要條件致病病原體［1］。喹諾酮類藥物是一類人工合成的具有高效廣譜抗菌作用的藥物。隨著喹諾酮類藥物的大量和廣泛的應(yīng)用，解脲支原體臨床分離株對該類藥物的敏感性逐漸下降出現(xiàn)耐藥［2～5］。

解脲支原體對喹諾酮類藥物的耐藥機制復(fù)雜，研究認(rèn)為Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶(包括DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ)是其作用靶酶，gyrA和parC基因分別編碼DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，基因上的一段與喹諾酮類耐藥相關(guān)的核苷酸序列被稱為喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining regions，QRDR)，其中g(shù)yrA基因5'末端第202～531位堿基(即編碼GyrA第68～177位氨基酸殘基的堿基)和parC基因5'末端第152～456位堿基(即編碼GyrA第51～152位氨基酸殘基的堿基)組成各自的QRDR區(qū)，QRDR區(qū)堿基突變導(dǎo)致編碼的氨基酸突變抑制細(xì)菌DNA螺旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性導(dǎo)致耐藥［6］。本研究分離了42株解脲支原體臨床菌株并檢測其對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和司帕沙星3種喹諾酮類藥物的耐藥性，PCR擴增所有菌株gyrA和parC基因包括QRDR在內(nèi)的核苷酸序列并直接測序，以探討本地區(qū)解脲支原體gyrA和parC基因的QRDR突變與喹諾酮類藥物耐藥的相關(guān)性。

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金資助項目(2004A018)

200120上海市東方醫(yī)院(王春艷、杜江);310053杭州，浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校(吳森林、孫愛華)

孫愛華，教授，碩士生導(dǎo)師，電子信箱:sunah123@126．com