朱華 劉穎 秦川

恒河猴糖尿病動(dòng)物模型血清超氧化物歧化酶和丙二醛的檢測(cè)及意義

朱華 劉穎 秦川

目的對(duì)糖尿病恒河猴血清中的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，探討其在在非人靈長(zhǎng)類糖尿病并發(fā)腎病模型中的應(yīng)用價(jià)值。方法健康恒河猴5只，小劑量30mg/kg多次靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)，血糖穩(wěn)定后觀察血清中SOD和MDA的含量。連續(xù)觀察13個(gè)月。結(jié)果造模后動(dòng)物血清中的SOD值降低，在8個(gè)月出現(xiàn)顯著性差異(P＜0．05)，11個(gè)月出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0．01)。MDA含量持續(xù)上升，9個(gè)月出現(xiàn)顯著性差異(P＜0．05)，13個(gè)月出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0．01)。血糖與SOD呈負(fù)相關(guān)(F=-0．186，-0．323，P＜0．05)，血糖與MDA呈正相關(guān)(F=0．128，0．087，P＜0．05)，SOD與MDA無(wú)相關(guān)關(guān)系。結(jié)論測(cè)定血清SOD，MDA含量可以在一定程度上反應(yīng)恒河猴糖尿病微血管病變的程度。

超氧化物歧化酶丙二醛糖尿病恒河猴

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:成年恒河猴5只，雄性，體重5．5～6．5kg。購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(軍)2007-001。

2．模型制作方法:采集本底指標(biāo)后，連續(xù)3天靜脈注射STZ。末次注射72h后檢測(cè)末梢血糖，動(dòng)物的血糖出現(xiàn)降低則再次注射STZ。

3．檢測(cè)方法及頻率:動(dòng)物禁食后于清晨采集靜脈血，離心后檢測(cè)SOD和MDA。樣品由北京中同藍(lán)博臨床檢測(cè)所檢測(cè)，均采用比色法。SOD的測(cè)定通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧離子自由基，自由基氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色。被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基有專一的抑制作用，形成的亞硝酸鹽減少。比色時(shí)測(cè)定管的吸光度低于對(duì)照管的吸光度。通過(guò)測(cè)定亞硝酸鹽濃度求出被測(cè)樣品中的SOD活力。MDA測(cè)定根據(jù)丙二醛可與硫代巴比妥鈉縮合形成紅色產(chǎn)物的原理。使用ST-360酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。

4．檢查頻率及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:血糖穩(wěn)定后每月檢查1次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，應(yīng)用SPSS 13．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，各指標(biāo)的相關(guān)性用線性回歸分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1．血清中SOD與MDA含量:動(dòng)物模型血清中的SOD值隨血糖的升高而降低，MDA值隨血糖的升高而升高。SOD含量8個(gè)月出現(xiàn)顯著性差異(P＜0．05)，11個(gè)月出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0．01)。丙二醛含量持續(xù)上升，9個(gè)月出現(xiàn)顯著性差異(P＜0．05)，13個(gè)月出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0．01)。

表1 造模前后血清中SOD和MDA值

表1 (續(xù))造模前后血清中SOD和MDA值

2．SOD的單因素方差分析:血糖與SOD呈負(fù)相關(guān)(F=-0．186，-0．223，P＜0．05)，血糖與MDA呈正相關(guān)(F=0．128，0．087，P＜0．05)，SOD與MDA無(wú)相關(guān)關(guān)系(表2)。

表2 糖尿病恒河猴SOD的單因素方差分析

3．SOD的單因素回歸分析:SOD和MDA是血糖的相關(guān)因子，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)(表3)。

表3 糖尿病恒河猴SOD的單因素線性回歸分析

討論

正常生理狀態(tài)下體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生超氧化物陰離子、自由基等代謝產(chǎn)物。自由基是一種生物氧化劑，能使脂質(zhì)過(guò)氧化及蛋白質(zhì)氧化，損害細(xì)胞及細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞的正常生理功能。而細(xì)胞內(nèi)存在清除自由基的體系:在需氧代謝細(xì)胞中都含有SOD，它能使超氧化物陰離子變?yōu)镠2O2和氧分子，清除氧自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷，使機(jī)體代謝過(guò)程中氧自由基與氧抑制劑處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)［4，5］。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，是自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物。MDA堆積會(huì)引起細(xì)胞損傷。糖尿病時(shí)，由于患者血糖升高，糖化血紅蛋白生成增多，氧合血紅蛋白減少，紅細(xì)胞攜氧能力下降，加之血糖升高致血液黏稠度升高，微血管灌注不良，均可致組織細(xì)胞缺氧，促進(jìn)了自由基的形成。同時(shí)血糖本身亦可以自發(fā)地氧化產(chǎn)生自由基，使自由基增多［6，7］。當(dāng)患者的抗過(guò)氧化能力降低，不能將其及時(shí)地清除時(shí)，必然導(dǎo)致自由基在體內(nèi)的量堆積，加重了組織細(xì)胞的損害，進(jìn)而導(dǎo)致其功能受損。

在所有種類的糖尿病動(dòng)物模型中，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中所觀察到的血糖規(guī)律、病理特征與人類糖尿病患者的臨床特征最為相似。但有關(guān)恒河猴糖尿病模型腎臟抗氧化能力還未見(jiàn)報(bào)道。我們的研究表明，隨著血糖的增高，糖尿病恒河猴體內(nèi)做為脂質(zhì)過(guò)氧化物終產(chǎn)物的MDA含量逐漸增高，到造模后9個(gè)月已明顯高于正常水平(P＜0．05)，到模型成立的第13個(gè)月已出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0．01)。做為抗氧化防御系統(tǒng)重要組成成分的SOD含量卻逐漸降低，在造模后8個(gè)月出現(xiàn)顯著性差異(P＜0．05)，11個(gè)月出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0．01)。而且血糖與SOD呈負(fù)相關(guān)性，MDA與血糖呈正相關(guān)性，這也與臨床的報(bào)道相符［8，9］。表明恒河猴糖尿病模型的氧化應(yīng)激功能亢進(jìn)，抗氧化能力降低。

根據(jù)結(jié)果我們可以推測(cè):同臨床病人相似，自由基生成增多是引起恒河猴糖尿病微血管病變的原因之一，氧化應(yīng)激參與了微血管病變的發(fā)生發(fā)展。因而測(cè)定血清SOD，MDA含量可以在一定程度上反應(yīng)恒河猴糖尿病微血管病變的程度。因?yàn)槟Ｐ瓦€在繼續(xù)觀察中，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束動(dòng)物安樂(lè)后，可從組織病理學(xué)方面給對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1Aksakal E，Akaras N，Kurt M．The role of oxidative stress in diabetic cardiomyopathy:an experimental study［J］．Eur Rev Med Pharmacol Sci，2011，15(11):1241-1246

2Sangeetha MK，Balaji Raghavendran HR，Gayathri V，et al．Cordifolia attenuates oxidative stress and distorted carbohydrate metabolism in experimentally induced type 2 diabetes in rats［J］．J Nat Med，2011，65(3 -4):544-550

3丁紅香，邵美娟．Ⅱ型糖尿病患者一氧化氮，超氧化物歧化酶與丙二醛含量的變化［J］．中國(guó)糖尿病雜志，2002，2(10):116-119

4Macut D，Simic T，Lissounov A．Insulin resistance in non-obese women with polycystic ovary syndrome:relation to byproducts of oxidative stress［J］．Exp Clin Endocrinol Diabetes，2011，119(7):451-455

5Jomova K，Valko M．Advances in metal-induced oxidative stress and human disease［J］．Toxicology．2011，10(3):65-87

6Morceli G，F(xiàn)ran?a EL，Magalh?es VB，et al．Diabetes induced immunological and biochemical changes in human colostrum［J］．Acta Paediatr，2011，100(4):550-556

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8李憶農(nóng)，盧純朝，徐向進(jìn)，等．NIDDM患者紅細(xì)胞超氧化物歧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性與腎功能相關(guān)性研究［J］．中華內(nèi)分泌代謝雜志，1996，16(2):15-17

9Shen X，Zheng S，Metreveli NS，et al．Epstein PN:Protection of cardiac mitochondria by overexpression of MnSOD reduces diabetic cardiomyopathy［J］．Diabetes，2006，55(3):798-805

(收稿:2012-02-15)

(修回:2012-03-01)

An Examination on SOD and MDA in the Serum of Macaques Monkey and Its Clinical Significance．

Zhu Hua，Liu Ying，Qin Chuan．Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science(CAMS)＆Comparative Medical Center，Peking Union Medical College(PUMC)，Beijing 100021，China

ObjectiveTo study the content of superoxied dismutase(SOD)and MDA in serum of macaques Monkey and its clinical significance in macaques Monkey．MethodsWe used streptozotocin(30mg/kg of body weight，intravenously，3days)to five macaques．The dynamic changes of superoxied dismutase(SOD)and MDA in serum were measured for 13 months．ResultsAs a result，the SOD in macaques Monkey's serum were lower than those of before injection，and the difference was of statistically significance at the 8th month (P＜0．05)．The level of MDA in the serum were higher than those of before injection，and the difference was of statistically significance at the 9th month(P＜0．05)．Significantly negative correlations were observed between SOD and Glu(F=-0．186，-0．323，P＜0．05)．Significantly positive correlations were observed between MDA and Glu(F=0．128，0．087，P＜0．05)．There was no correlation between SOD and MDA．ConclusionThe results showed that the detection of SOD and MDA reflectes the viability of antioxidase in diabetic macaques Monkey．The cause of diabetes is related with free radical．

Superoxied dismutase(SOD);MDA;Diabetes;Macaques

腎功能損傷是糖尿病合并微血管病變的重要并發(fā)癥，病程進(jìn)展與代謝控制不良、長(zhǎng)期高血糖以及多種易感基因的多態(tài)性密切相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前認(rèn)為糖尿病時(shí)存在的機(jī)體氧化應(yīng)激損傷也參與了這一發(fā)展過(guò)程。測(cè)定丙二醛(MDA)含量的高低可間接反映機(jī)體細(xì)胞受氧自由基損傷的程度，超氧化物歧化酶(SOD)的檢測(cè)可間接反映機(jī)體抗氧化的能力。有文獻(xiàn)報(bào)道2型糖尿病模型動(dòng)物和糖尿病患者體內(nèi)自由基反應(yīng)明顯增強(qiáng)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增加，并認(rèn)為過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)是糖尿病發(fā)生、發(fā)展和并發(fā)癥產(chǎn)生的重要原因之一［1～3］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)糖尿病恒河猴血清中的SOD和MDA進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，旨在探討這兩個(gè)指標(biāo)在非人靈長(zhǎng)類糖尿病并發(fā)腎病模型中的應(yīng)用價(jià)值。

國(guó)家科技重大專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2009ZX09503-025)

100021衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心

秦川，教授，博士生導(dǎo)師，電子信箱:chuanqin@vip．sina．com