劉瑞興 張智敏 吳蘇喜 黃閃閃

(長沙理工大學化學與生物工程學院，長沙 410114)

油茶(Camellia oleifera Abel.)是我國特有的木本油料樹種，也是世界四大食用木本油料樹種之一［1］。經測試，油茶籽油的油酸及亞油酸含量均高于橄欖油，物理化學特性也與橄欖油非常相似［2］。油茶籽油中還含有豐富的VE、VD、胡蘿卜素、磷脂、角鯊烯等其他生物活性成分，長期食用后具有明顯的預防各種心腦血管疾病、延緩動脈粥樣硬化降血壓、降血脂等功效［3－5］，是一種優(yōu)質的保健食用油。脫脂去皂后的餅粕還含有14%的粗蛋白，25%的粗脂肪，都是很重要的工業(yè)原料［6］。

油茶籽油傳統(tǒng)制取方法主要為壓榨法和浸出法。水酶法作為一種新興的植物油脂提取技術，與傳統(tǒng)方法相比，具有操作溫度低，能耗低，提取的油純度高，磷脂含量、酸值及過氧化值低，色澤淺，污染少的優(yōu)點，符合“安全、高效、綠色”的要求［7－9］。目前，油茶籽油的水酶法制取方面國內還處于起步階段［10－11］。本試驗將超聲波輔助技術應用到油茶籽油的酶法提取中，摸索影響出油效率的工藝條件，同時對酶法提油茶籽油的酸值、過氧化值、苯并(α)芘以及VE、角鯊烯、不飽和脂肪酸等含量進行了分析測定，以揭示酶法提取工藝對油茶籽油營養(yǎng)品質、衛(wèi)生品質及理化性質的影響，為油茶籽油綜合開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽:2010年購自農戶;30－60石油醚:國藥集團化學試劑有限公司;硫酸、鹽酸:衡陽市凱信化工試劑有限公司;氫氧化鈉:西隴化工股份有限公司;無水乙醇、無水乙醚(分析純):衡陽市凱信化工試劑有限公司;抗壞血酸:天津市化學試劑一廠;維生素E標準品:美國Supelco公司;3，4－苯并(α)芘標準品(99%):Sigma;角鯊烯標準品(純度99%):北京恒元啟天化工技術研究院;中性蛋白酶NCB－A5、纖維素酶AE80、果膠酶、α－淀粉酶:湖南尤特爾生化有限公司。

1.2 主要儀器與設備

SHA－B恒溫水浴振蕩器:江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;UV754紫外可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司;GC－14C氣相色譜儀(FID檢測器)、LC－20AT高效液相色譜儀(紫外檢測器，C18色譜柱)、AUY120電子分析天平(0.0001 g):日本島津公司;KQ3200DA超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;MAXI－MIXⅡ渦旋混合器:美瑞泰克科技有限公司;RE－52AA旋轉蒸發(fā)器:上海雅榮生化設備儀器有限公司;DELTA 320 pH計:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;JJ－1型定時電動攪拌器:江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;LD5－10臺式離心機:北京京立離心機有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 油茶籽仁主要成分測定

水分測定:GB/T 5497—1985 105℃恒重法;粗脂肪測定:GB/T 14772—2008索氏抽提法;粗蛋白測定:GB/T 14489.2—1993凱氏法;淀粉含量的測定:GB/T 5514—2008糧油檢驗 糧食、油料中淀粉含量測定;茶皂素含量的測定:參考文獻［12］。

1.3.2 水酶法制取油茶籽油的工藝流程

油茶籽→干燥→去殼→粉碎→40目篩下物→加緩沖溶液→90℃水浴加熱30 min→調節(jié)pH和溫度→加酶→反應→滅酶→破乳→離心分離→取上層清油→干燥至恒重→油茶籽油 ↓

測蛋白水解率←干燥至恒重←殘渣

1.3.3 單因素試驗

取20 g去殼粉碎后過20目的油茶籽，依照1.3.2工藝，分別研究超聲時間、加熱預處理時間、加熱預處理溫度、酶的種類、料液比、加酶量、酶解pH、酶解溫度和酶解時間對油茶籽水酶法出油效率的影響。試驗重復1次。

1.3.4 優(yōu)化試驗

多因素試驗采用Box－Behnken設計，利用響應曲面法進行分析優(yōu)化［13－14］。

1.3.5 油茶籽油中苯并(α)芘的測定［15］

采用反相高效液相色譜法對苯并(α)芘進行測定。其色譜條件如下:保護柱為Phenomenex C18(5 μm，4 mm ×3.0 mm);色譜柱:島津 inertsil ODS －SP C18 柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流動相:乙腈/水(90/10);流速:1.0 mL/min;激發(fā)波長 384 nm，發(fā)射波長406 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:10 μL。

1.3.6 油脂理化指標及主要營養(yǎng)成分分析方法

1.3.6.1 理化指標

酸價:參考GB/T 5530—2005動植物油脂酸值和酸度測定;過氧化值:參照GB/T 5538—2005油脂過氧化值測定;色澤:參考GB/T 22460—2008動植物油脂羅維朋色澤的測定;水分及揮發(fā)物含量:參照GB/T 5528—2008電烘箱105℃恒質量法;透明度、氣味、滋味:參照GB/T 5525—2008感官鑒定法;VE:參照 GB/T 5009.82—2003;脂肪酸:參考文獻［16］。

1.3.6.2 角鯊烯的測定

色譜柱:ZB －5(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);升溫程序:初溫180℃，以10℃/min升溫至280℃，保持20 min;進樣口溫度:290℃;檢測器溫度:300℃;載氣:高純氮氣;載氣流速:2 mL/min;進樣方式:不分流進樣;進樣量:1 μL。

角鯊烯標準儲備液:精密稱取角鯊烯10 mg置10 mL容量瓶中，加正己烷適量，振搖，使角鯊烯溶解后，再加正己烷至刻度，搖勻，為1 mg/mL的角鯊烯儲備液。

角鯊烯標準系列溶液:取適量的1 mg/mL的角鯊烯標準儲備液用正己烷依次梯度稀釋成濃度為40、80、120、160、200 μg/mL 的標準液。

樣品的制備:精確稱取油樣約 0.200 0 g，于1.5 mL的離心管中，用正己烷定容到1 mL，搖勻，待氣相色譜檢測。

2 結果與討論

2.1 油茶籽仁主要成分

表1 油茶籽仁主要成分含量/%

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶的種類

固定加酶量為1%(復合酶為蛋白酶0.5%+纖維素酶0.5%)，料液比為1∶5，加熱預處理時間為20 min，加熱預處理溫度為90℃，超聲時間為20 min，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，分別使用不同種類的酶在同等條件下進行反應，結果如圖1所示。

圖1 酶的種類對出油效率的影響

由圖1可知，蛋白酶對出油效率影響最大，而破壞細胞膜結構的纖維素酶和果膠酶次之，效果最不明顯的為α－淀粉酶，蛋白酶與纖維素酶的共同作用能夠顯著提高出油效率。這說明，經過超聲波和加熱預處理的破壁作用后，細胞壁結構已經一定程度地松解，影響油脂釋放的主要因素為與油脂結合的脂蛋白，因此加入少量纖維素酶或果膠酶繼續(xù)降解細胞壁骨架，再加入蛋白酶水解蛋白后，油脂就能夠得到有效地釋放，從而提高出油效率。

2.2.2 加酶量

固定酶種類為復合酶(蛋白酶∶纖維素酶=4∶1)，料液比為1∶5，加熱預處理時間為20 min，加熱預處理溫度為90℃，超聲時間為20 min，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，分別加入不同用量的酶(占油茶籽原料質量的百分比)在同等條件下進行反應，結果如圖2所示。

圖2 加酶量對出油效率的影響

由圖2可知，加酶量在2.5%(占油茶籽原料質量)以內，隨著酶用量的增加，出油效率呈上升趨勢，2.5%以后，出油效率稍微降低，然后趨于恒定。因此加酶量為2.5%。

2.2.3 加熱預處理時間

固定酶種類為復合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，加熱預處理溫度為90℃，超聲時間為20 min，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變加熱預處理時間，在同等條件下進行反應，結果如表2及圖3所示。

表2 加熱預處理時間對出油效率的影響

據文獻報道，蒸汽預處理是為了使油茶籽的脂肪酶失活，同時使細胞壁疏松，增加滲透性和便于酶的作用，使油更容易釋放出來［17］。

由圖3可知，蒸汽處理時間在20 min內，延長蒸汽處理時間，出油效率有所提高，但變化緩慢，處理時間超過20 min，則出油效率開始下降。分析原因可能是常壓蒸汽處理有利于植物細胞壁結構變得松弛，使得酶易于進入細胞內部發(fā)生作用，從而提高出油效率，但是蒸汽處理時間過長，會產生乳化現(xiàn)象，出油效率反而下降。最后選定蒸汽處理時間為20 min。

圖3 加熱預處理時間對出油效率的影響

2.2.4 加熱預處理溫度

固定酶種類為復合酶(蛋白酶∶纖維素酶=4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，加熱預處理時間為20 min，超聲時間為20 min，酶解 pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變加熱預處理溫度，在同等條件下進行反應，結果如表3及圖4所示。

表3 加熱預處理溫度對出油效率的影響

圖4 加熱預處理溫度對出油效率的影響

由圖4可知加熱預處理溫度在90℃以內，隨著溫度的升高，出油效率呈上升趨勢，90℃以上，出油效率急劇降低，原因可能是較高溫度導致油脂被破壞，從而使出油效率下降。因此選定加熱預處理溫度為90℃。

2.2.5 超聲時間

固定酶種類為復合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，加熱預處理時間為20 min，加熱預處理溫度為90℃，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變超聲時間，在同等條件下進行反應，結果如圖5所示。

圖5 超聲時間對出油效率的影響

由圖5可知，0～20 min內，隨著超聲時間的增長，出油效率增大，20 min后，出油效率急劇減小，分析原因是超聲時間過長，油脂出現(xiàn)明顯的乳化作用，降低了出油效率。因此，選定超聲時間為20 min。

2.2.6 料液比

固定酶種類為復合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，超聲時間為 20 min，加熱預處理時間為20 min，加熱預處理溫度為90℃，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變料液比，在同等條件下進行反應，結果如圖6所示。

圖6 料液比對出油效率的影響

由圖6可知，料液比高于1∶5時，水過少，不利于酶解，當料液比低于1∶5時，水的增多，導致出油效率降低，因此選定料液比為1∶5(即5 mL/g)。

2.2.7 酶解 pH

固定酶種類為復合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，超聲時間為 20 min，加熱預處理時間為20 min，加熱預處理溫度為90℃，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變酶解pH，在同等條件下進行反應，結果如圖7所示。

圖7 酶解pH對出油效率的影響

復合酶以蛋白酶的用量居多，因此出油效率主要受蛋白酶活性的pH影響，由圖7可知，在復合酶的共同作用下，酶解pH 6.5時，出油效率最高。

2.2.8 酶解溫度

固定酶種類為復合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，超聲時間為 20 min，加熱預處理時間為20 min，加熱預處理溫度為90℃，酶解pH 6.9，酶解時間為5 h，改變酶解溫度，在同等條件下進行反應，結果如圖8所示。

圖8 酶解溫度對出油效率的影響

復合酶以蛋白酶的用量居多，因此出油效率主要受蛋白酶活性的溫度影響，由圖8可知，在復合酶的共同作用下，酶解溫度為50℃時，出油效率最高。

2.2.9 酶解時間

固定酶種類為復合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，超聲時間為 20 min，加熱預處理時間為20 min，加熱預處理溫度為90℃，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，改變酶解時間，在同等條件下進行反應，結果如圖9所示。

由圖9可知，反應5 h以內，出油效率隨著時間的增長而明顯增大，5 h后，出油效率反而下降，因此酶解時間以5 h為宜。

通過單因素試驗得到水酶法提取油茶籽油的最佳條件:超聲時間20 min，加熱預處理90℃、20 min，加酶量2.5%(考慮到蛋白酶作用最大，而且其質量分數大于2%時，提油效果顯著，于是將蛋白酶、纖維素酶用量配比定為 4∶1)，料液比 1∶5，酶解pH 6.5，酶解溫度50℃，酶解時間5 h。

圖9 酶解時間對出油效率的影響

2.3 響應面優(yōu)化試驗

在預做試驗結果的基礎上，選取料液比、加酶量、酶解 pH、酶解溫度，用 Design expert軟件中的Box－Behnken模型進行響應面優(yōu)化試驗設計［18－20］，以出油效率(Y)為評價指標。響應面優(yōu)化試驗的因素水平表見表4，試驗方案及結果見表5。

表4 響應面因素水平表

表5 中心組合試驗設計方案與結果

續(xù)表

2.3.1 不同因素對出油效率的影響

由表5試驗結果得到出油效率(Y)與料液比(X1)、加酶量(X2)、酶解pH(X3)和酶解溫度(X4)之間的二次多元回歸模型:

利用統(tǒng)計分析軟件Design expert對表5試驗結果進行方差分析，結果見表6。

表6 回歸方程的方差分析

由表6可知，料液比、加酶量、酶解溫度、加酶量的平方、酶解pH的平方、酶解溫度的平方對出油效率的影響極顯著(P＜0.01);加酶量與酶解pH的交互項、料液比的平方對出油效率的影響顯著(P＜0.05);影響因素主次順序為:加酶量＞酶解溫度＞料液比＞酶解pH。模型的P值＜0.000 1，表明該回歸方程線性極顯著;失擬值為0.153 4(P＞0.05)，失擬不顯著;并且該模型R2=0.963 2，R2Adj=0.926 3，以上均表明該回歸方程擬合程度好。

為了使模型更真實準確地反映數據實際情況，將模型進行優(yōu)化。優(yōu)化后回歸方程的方差分析見表7。

表7 優(yōu)化后回歸方程的方差分析

由表7試驗結果得到萃取得率(Y)與料液比(X1)、加酶量(X2)、酶解pH(X3)和酶解溫度(X4)之間的二次多元回歸模型:

2.3.2 各因素間的交互作用對出油效率響應面的分析

利用Design expert軟件對試驗數據進行多項回歸擬合，做各因素間交互作用的二次響應面分析。

將建立的回歸模型中的任意兩因素固定在零水平，得到另外兩因素的交互影響結果:二次回歸方程的響應面及其等高線見圖10～圖12。等高線表示在同一橢圓形區(qū)域里，出油效率是相同的，在橢圓形區(qū)域中心，出油效率最大，并逐漸向邊緣減少。圖中橢圓排列越密集，表明因素的變化對出油效率影響越大。圖反映出出油效率在各因素的中心點附近可獲得最大值，并且只有加酶量與酶解pH的交互項對出油效率影響顯著，加酶量是影響出油效率的最主要因素。

2.3.3 最佳工藝條件及其驗證試驗

通過Design expert軟件分析，得出最佳酶解條件為:酶用量2.62%，酶解溫度 52.1 ℃，料液比 1∶5.58，酶解 pH 6.47。在該條件下，出油效率有最優(yōu)值83.6%。

在此條件下進行3組平行驗證試驗的平均得率為83%，與軟件估測值83.6%基本一致，說明響應面法優(yōu)化出來的該工藝條件(酶用量2.62%，酶解溫度52.1 ℃，料液比1∶5.58，酶解 pH 6.47)是可行的。

2.3.4 蛋白水解率的測定結果

將2.3.3驗證試驗中的3組平行樣品，通過凱氏定氮法分別測定其酶解殘渣的粗蛋白含率，利用公式(2)計算得到水酶法提取油茶籽油的平均蛋白水解率高達90.4%。說明，水酶法提取植物油的原理之一是靠大量水解油茶籽中的蛋白質，導致油茶籽子葉細胞的蛋白質網絡結構破裂和包圍著脂質體的那些脂蛋白分解，從而使油脂釋放出來［21－23］。

2.4 油茶籽油中苯并(α)芘含量的測定結果

將2.3.3驗證試驗中的3組平行樣品制得的油茶籽油分別測定苯并(α)芘的含量，結果見表8。

表8 水酶法制油茶籽油中的苯并(α)芘含量

由表8可以看出，水酶法提取的油茶籽毛油的苯并(α)芘含量完全在安全范圍內(GB 2716—2005中規(guī)定，食用植物油中苯并(α)芘含量的上限值是10 μg/kg)。

2.5 油脂理化指標及主要營養(yǎng)成分測定結果

以優(yōu)化后的最佳酶解條件制得的油茶籽油進行理化指標測定及主要營養(yǎng)成分測定，結果見表9。

表9 水酶法制油茶籽油的理化指標及主要營養(yǎng)成分

由表9可以看出，該毛油的色澤、氣味和滋味、酸價、過氧化值等理化指標均已達到國家壓榨一級油茶籽油的標準要求［24］，可以不經過完全精煉。水酶法制取的油茶籽油中主要不飽和脂肪酸的質量分數高達87.8%，其中富含油酸及亞油酸，GB 11765—2003描述油茶籽的主要脂肪酸組成為飽和酸7%～11%、油酸74%～87%、亞油酸7%～14%，本研究所測得的各項脂肪酸指標均在標準范圍內。水酶法制得的油茶籽油中微量物質角鯊烯含量為 114.4 mg/kg，VE 含量高達204.5 mg/kg，高于文獻［3］所述橄欖油的VE含量168 mg/kg。這說明環(huán)境友好型的低溫制油工藝——水酶法對生物活性成分具有保護優(yōu)勢。

3 結論

3.1 水酶法提取油茶籽油的最佳工藝條件為:酶用量 2.62%(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，酶解溫度 52.1℃，料液比1∶5.58，酶解 pH 6.47，超聲時間 20 min，加熱預處理90℃、20 min，酶解時間5 h。在此條件下，出油效率高達83%，蛋白水解率為90.4%。

3.2 水酶法提取的油茶籽毛油的苯并(α)芘含量完全在安全范圍內。

3.3 水酶法提取油茶籽毛油色澤清亮，無異味，酸價、過氧化值等理化指標均合格，污染少，無須精煉加工，節(jié)約了油脂加工的成本。此外，水酶法加工過程對不飽和脂肪酸、VE、角鯊烯等生物活性成分保留較好，是一種“安全、高效、綠色”的制油工藝。

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