劉中祿，陶翠蘭，莘旭妮，李樹(shù)民

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400042;2.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130062)

重組胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的構(gòu)建與表達(dá)

劉中祿1，陶翠蘭1，莘旭妮2，李樹(shù)民2

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400042;2.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130062)

目的 構(gòu)建表達(dá)重組胸腺素α1(Tα1)的 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法 將人工合成的Tα1序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的片段和pMAL-C2x質(zhì)粒載體分別經(jīng)BamHI和EcoR I雙酶切后，用T4 DNA快速連接酶連接構(gòu)建pMAL-C2x-Tα1融合表達(dá)質(zhì)粒，再經(jīng)測(cè)序正確后，將重組體轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TB1菌中，pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白與 Tα1的融合蛋白(MBP-Tα1)，采用Westernblot對(duì)MBP-Tα1進(jìn)行鑒定。結(jié)果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表達(dá) MBP-Tα1，融合蛋白占菌體蛋白的33.6%，分子量約為45×103。結(jié)論 工程菌的成功構(gòu)建和表達(dá)為重組Tα1的純化、生物學(xué)活性等研究奠定了基礎(chǔ)。

重組胸腺素α1;基因克隆;質(zhì)粒pMAL-C2x;融合表達(dá)

胸腺素 α1(thymosin alpha 1，Tα1)是最早從小牛胸腺中提取的胸腺素組分5(TF5)中分離出來(lái)的一種多肽，由28個(gè)氨基酸組成，pI值為4.2，相對(duì)分子質(zhì)量為3108×103，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑和增強(qiáng)劑，能促進(jìn) T淋巴細(xì)胞的增殖［1］，提高淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素和IL-2等細(xì)胞因子的能力，提高機(jī)體抗菌和抗感染的能力。目前Tα1已用于乙型肝炎、丙型肝炎［2］、惡性腫瘤［3］及免疫缺陷疾?。?］等的臨床治療。

市場(chǎng)在售的 Tα1主要是由化學(xué)合成，成本高，價(jià)格昂貴，限制其在獸藥領(lǐng)域的應(yīng)用。由于該蛋白質(zhì)的編碼序列過(guò)短，難于用基因工程的方法直接獲得，因此，主要采用融合表達(dá)及串聯(lián)拷貝法進(jìn)行表達(dá)。薛曉暢等［5］獲得了序列正確的三串體基因，成功地實(shí)現(xiàn)原核表達(dá);石繼紅等［6，7］將 Tα1串體與硫氧還蛋白融合，獲得高效表達(dá)的可溶性融合蛋白;苗紅等［8］、修朝陽(yáng)等［9］和謝琦等［10］研究了 Tα1 與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)在大腸埃希菌中的融合表達(dá)。本試驗(yàn)擬采用原核表達(dá)載體 pMAL-C2x，表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)與Tα1的融合蛋白，克服了小分子肽難于表達(dá)的困難，為進(jìn)一步研究重組胸腺素α1純化與生物學(xué)活性及在獸藥領(lǐng)域開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸埃希菌(Escherichia coli)DH5α菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存;E.coli TB1 菌株、pUC57、pMAL-C2x購(gòu)自New England Biolabs公司;Tαl基因片段:5'GAA TTC TCT GAT GCT GCT GTT GAT ACT TCT TCT GAG ATT ACT ACT AAA GAT CTT AA G GAG AAG AAG GAA GTT GTC GAA GAG GCT GAG AACTAG GGA TCC 3。引物:P1(5'to 3'):GCGCGGATCC TCGGA TGCGGCCG TGGATACC，P2(5'to3'):GCGCGAATTCTCATTAATTTTCCGCCTC。Tαl基 因片段及PCR引物均并由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒小量快速提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;IPTG和SDS購(gòu)自Sigma公司;胰蛋白胨及酵母提取物購(gòu)于英國(guó) Oxid公司;限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoR I和 Bgl II，T4 DNA 快速連接酶、DL2000 DNA Marker購(gòu)自Takara公司;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 pMAL-C2x-Tα1融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 Tαl基因的獲得

以PCR法擴(kuò)增人工合成的 Tαl基因片段，含BamHI(GGATCC)和 EcoRI(GAATTC)酶切位點(diǎn)、終止密碼子 TAG。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性 10 min，95℃10 s，52℃10 s，72℃20 s，30 個(gè)循環(huán)。72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定檢測(cè)結(jié)果。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切取目的條帶，用試劑盒進(jìn)行純化回收，經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后備用。

1.3.2 重組體pMAL-C2x-Tα1的構(gòu)建

以BamHI和 EcoRI雙酶切pMAL-C2x質(zhì)粒DNA，用DNA快速連接試劑盒將同樣雙酶切后的Tα1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接體系(10 μL):2×T4 DNA快速連接酶buffer，5 μL;T4 DNA快速連接酶，0.5 μL;大片段 pMAL-C2x，1 μL;小片段 Tα1，3.5 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌 DH5α，挑取固體平板上的單個(gè)菌落，液體LB增菌抽提質(zhì)粒后，以BglII和EcoRI酶進(jìn)行重組體的雙酶切鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒 pMAL-C2x-Tα1送 Takara公司測(cè)序。

1.4 重組Tαl在大腸埃希菌TB1中的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒 pMAL-C2x-Tα1轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli TB1中，取菌液涂布于含 Amp的LB篩選平板上，37℃培養(yǎng)16 h后篩選陽(yáng)性單菌落，LB液體培養(yǎng)37℃振搖(200 r/min)培養(yǎng)12～14 h。取培養(yǎng)好的菌液100 μL加入到含氨芐青霉素(50 μg/mL)10mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖(200 r/min)培養(yǎng)至 OD600達(dá)到 0.5～0.6后，加入 0.05mmol/L IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 h。分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)3 h后菌液，離心，收集菌體去上清，常規(guī)進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳。AlphaEase凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析樣品中所含MBP融合蛋白的比例。

1.5 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌表達(dá)的鑒定-免疫印記(Western blot)

蛋白質(zhì)免疫印跡按常規(guī)方法進(jìn)行，表達(dá)菌SDSPAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，經(jīng)20 g/L BSA封閉液封閉后，與小鼠抗His-Taq單克隆抗體結(jié)合，經(jīng)酶標(biāo)二抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)及顯色獲得陽(yáng)性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Tαl基因的獲得

如圖1所示，擴(kuò)增DNA片段2%瓊脂糖凝膠電泳，顯示大小為100 bp的目的片段。Tα1基因的PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性。

2.2 重組體pMAL-C2x-Tα1的構(gòu)建

小量制備 pMAL-C2x-Tα1重組體質(zhì)粒，以 Bgl II和EcoR I酶切后，2%瓊脂糖凝膠電泳顯示在800 bp處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性(圖2)。測(cè)序結(jié)果為陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMAL-C2x-Tα1。

圖2 pMAL-C2x-Tα1重組體的酶切鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant expression vecter

2.3 重組Tαl在大腸埃希菌TB1中的誘導(dǎo)表達(dá)

將目的片段連入表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性菌株，在IPTG誘導(dǎo)下，能穩(wěn)定表達(dá)MBP-Tαl融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物的12%SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組Tαl在大腸埃希菌TB1中以可溶性方式表達(dá)(如圖3)，重組誘導(dǎo)表達(dá)菌在分子量約45×103處有明顯特異性條帶出現(xiàn)，與預(yù)期分子量大小相符，而誘導(dǎo)前空菌未出現(xiàn)相應(yīng)蛋白條帶。AlphaEase凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析樣品中所含BMP融合蛋白的占總菌體蛋白的33.6%。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的12%SDS-PAGE電泳Fig.3 12%SDS-PAGE anlysis of expressed products

2.4 pMAL-C2x-Tα1/TB1融合蛋白工程菌表達(dá)的鑒定結(jié)果-免疫印記

如圖4顯示，在與左一半電泳膠(誘導(dǎo)表達(dá)菌在分子量約45×103)上分子量相應(yīng)的考馬斯亮蘭R-250染色區(qū)帶的相應(yīng)位置，顯現(xiàn)單一條帶明顯的免疫印跡，表明融合蛋白與單抗有特異結(jié)合能力。

圖4 pMAL-C2x-Tα1/TB1融合蛋白免疫印跡分析Fig.4 Western blotting analysis of BMP-Tα1

3 討論

應(yīng)用基因重組技術(shù)將人工合成的基因?qū)氪竽c埃希菌進(jìn)行原核表達(dá)，是制備多肽藥物的有效方法。本研究以人工方法合成Tα1DNA，以 PCR擴(kuò)增Tα1基因，并在其首尾兩端分別加上在所用載體多克隆位點(diǎn)(MCS)中都存在的且方向相符的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)、終止密碼子(TAG)，便于以后的克隆和表達(dá)操作。這種利用人工合成寡核苷酸進(jìn)行基因重組的方法可以避免在目的序列中插入外源序列，從而產(chǎn)生完整的蛋白/多肽產(chǎn)物。

由于 Tα1的編碼基因序列過(guò)短，難于直接表達(dá)，因此，我們一方面采用大腸埃希菌偏好密碼子構(gòu)建肽基因，不僅提高了 Tα1 mRNA的翻譯效率，也有效避免了來(lái)自宿主菌蛋白酶的攻擊，在宿主細(xì)胞內(nèi)獲得較高的表達(dá)，另一方面利用 pMAL-C2x原核表達(dá)載體上的TAC啟動(dòng)子，使Tα1與麥芽糖結(jié)合蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可用凝血酶酶切后進(jìn)行分離。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)和12%SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量45×103處出現(xiàn)一條特異性條帶，正好是標(biāo)簽蛋白-MBP(相對(duì)分子質(zhì)量42500)與Tα1(相對(duì)分子質(zhì)量3108)的總和，與預(yù)期融合蛋白的相對(duì)分子量相符。通過(guò)特異性的免疫印記分析，出現(xiàn)了表達(dá)產(chǎn)物的特異帶，進(jìn)步一證實(shí)表達(dá)蛋白的正確性。

本研究結(jié)果表明，構(gòu)建的重組胸腺素α1 pMALC2x-Tα1/TB1工程菌可以高效融合表達(dá)，BMP融合蛋白占菌體總量的33.6%。影響融合表達(dá)的因素很多，我們將對(duì)影響融合表達(dá)量的因素以及融合蛋白的分離純化等做進(jìn)一步研究。

［1］Knutsen AP，F(xiàn)reeman JJ，Mueller KR，et al.Thymosin-alpha1 stimulates maturation of CD34+stem cells into CD3+4+cells in anin vitrothymic epithelia organ coculture model［J］. Int J Immunopharmacol，1999，21(1):15－26.

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［5］薛曉暢，顏真，石繼紅，等.重組胸腺素 α1的克隆、表達(dá)與純化［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(3):227－229.

［6］石繼紅，張英起，趙永同，等.胸腺素 α1基因的克隆表達(dá)及其生物學(xué)活性［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2001，17(3):344－349.

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Construction and Expression of Recombinant Tα1 pMAL-C2x-Tα1/TB1 Engineering Strain

LIU Zhong-lu1，TAO Cui-lan1，SHEN Xu-ni2，LI Shu-min2
(1.Laboratory Animal Center，Institute of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400042，China;2.Institute of Animal Science，The Academy of Military Medical Science，Changchun 130062，China)

Objective To construct an engineering strain of pMAL-C2x-Tα1/TB1 which can express Thymosin α1(Tα1).Methods Tα1 gene was synthesized and amplified by PCR，PCR product and pMAL-C2x vector were digested with restriction endonuclease BamHI and EcoR I respectively，and were linked with T4 DNA ligase to construct pMAL-C2x-Tα1.After being sequenced，pMAL-C2x-Tα1 vector was transformed into E.coli TB1 for fusion expression under induction of IPTG..The expressed product was identified by Western blot.Results The DNA sequence of the synthesized Tα1 gene was identical to the original design.The constructed recombinant plasmid pMAL-C2x-Tα1 was highly expressed in E.coli TB1.The BMP-Tα1 fusion protein was about 33.6% of the total bacteria protein and the relative molecular weight of BMP-Tα1 fusion protein was about 45×103.Conclusion The successful construction and expression of pMALC2x-Tα1/TB1 laid a foundation for the research of purification and biological acitivity of recombinant Tα1.

Recombinant Tα1;Gene clone;Plasmid pMAL-C2x;Fusion expression

S859;R332

A

1671-7856(2012)07-0013-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.004

2012-07-05

重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(30111-14281)。

劉中祿(1966－)，副教授，碩士，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物教學(xué)科研工作。

李樹(shù)民(1968－)，研究員，博士，研究方向:獸藥研發(fā)。E-mail:creatrun@yahoo.com.cn。