溫 海，秦海斌，賀星亮，朱 騫，高一龍，張匯東

(公安部南京警犬研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京210012)

犬瘟熱病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用

溫 海，秦海斌，賀星亮，朱 騫，高一龍，張匯東

(公安部南京警犬研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京210012)

目的 利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)建立一種檢測(cè)犬瘟熱病毒感染的新方法。方法 根據(jù)GenBank中NP基因序列，設(shè)計(jì)4條LAMP特異性引物，對(duì)反應(yīng)條件、特異性、可視化效果和應(yīng)用效果進(jìn)行研究。結(jié)果 在60℃等溫的條件下、1 h內(nèi)可完成RT-LAMP擴(kuò)增過(guò)程;特異性和可視效果良好;對(duì)63份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為71.4%(45/63)，檢出率高于RT-PCR的63.5%(40/63)。結(jié)論 建立的RT-LAMP檢測(cè)方法，顯示了較高的特異性和敏感性，而且兼具高效、快捷、可視化的優(yōu)勢(shì)，為臨床檢測(cè)犬瘟熱病毒感染提供了一種快速簡(jiǎn)便的新途徑。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;犬瘟熱病毒;檢測(cè)

犬瘟熱(canine distemper disease，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，可引起大批食肉目動(dòng)物的發(fā)病和死亡，死亡率高達(dá)30%～80%，其自然宿主包括犬科動(dòng)物(犬、狼、豺、狐等)，鼬科動(dòng)物(貂、臭鼬、黃鼠狼等)，浣熊科動(dòng)物(浣熊、小熊貓、大熊貓等)，還可感染靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(如日本獼猴等)［1］，近年來(lái)隨著生態(tài)環(huán)境改變和病毒的進(jìn)化，CDV自然感染的宿主范圍正在不斷擴(kuò)大［2］，已經(jīng)出現(xiàn)人感染 CDV的報(bào)道［3］。犬瘟熱病毒的常用檢測(cè)方法包括病毒分離、病理組織包涵體檢查、血清學(xué)檢測(cè)、核酸探針、原位雜交、膠體金快速診斷試紙條和RT-PCR等方法［3，4］，其中膠體金快速診斷試紙條和 RT-PCR在臨床診斷中的應(yīng)用最為廣泛，但是近幾年研究表明，試紙條的假陰性和假陽(yáng)性比例很高、準(zhǔn)確性較差，RT-PCR受樣本、RNA降解等因素的影響，檢出率遠(yuǎn)未達(dá)到理想水平，因此，為適應(yīng)臨床檢測(cè)對(duì)準(zhǔn)確性和可操作性的更高要求，我們應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立了 CDV的反轉(zhuǎn)錄－環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)快速診斷方法，進(jìn)一步提高了對(duì) CDV的檢出率、準(zhǔn)確性，增強(qiáng)了臨床實(shí)踐中及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)犬瘟熱病毒的能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要毒株和細(xì)胞:CDV-Onderstepoort株，由公安部南京警犬研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;63份待檢樣本(結(jié)膜分泌物23份、鼻拭子18份、死亡肺臟15，血清7份)，采集自南京和山東地區(qū)疑似CDV感染犬或水貂;非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所.

1.1.2 主要試劑:10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、BstDNA聚合酶(8 U/μL)購(gòu)自 New England BioLabs公司;5.0mmol/L Betaine購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司;dNTP mixture、AMV 酶(5 U/μL)、TaqDNA 聚合酶、DNA/RNA提取試劑盒均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的犬瘟熱病毒基因序列，用在線軟件 PrimerExplorerversion 4(http://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)在 NP 基因保守區(qū)域篩選4條RT-LAMP引物(表1)，引物由上海皓佳生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 RT-LAMP檢測(cè)方法的建立

1.3.1 RNA模板的制備:RNA采用TaKaRa RNA提取試劑盒進(jìn)行提取，立即進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。

1.3.2 RT-LAMP檢測(cè)體系:LAMP反應(yīng)總體積25 μL，內(nèi)含引物 BIP 和 FIP 各 1 μL(40 pmol)、F3 和B3 各 0.5 μL(10 pmol)、2.5 μL 10× ThermoPol反應(yīng)緩沖液［200mmol/L Tris-HCI，100mmol/L KCI，20mmol/L MgSO4，100mmol/L(NH4)2SO4，1.0%Tween 20］、4.0 μL 5.0mmol/L Betaine、4.0 μL 2.5mmol/L dNTPs mixture、8 U Bst DNA polymerise、2 μL 模板 RNA;1μL AMV(5 U/μL)，0.5 μL RNA 酶抑制劑(40 U/μL)，2μL RNA 模板，ddH2O 補(bǔ)足體積到 25 μL。體系在 60℃、63℃ 和 65℃ 孵育 30、45和60 min，孵育反應(yīng)結(jié)束后，再在80℃作用10 min終止反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的量選擇合適的擴(kuò)增條件。

1.3.2 LAMP特異性鑒定:提取CPIV GN株、CDV GN株和正常 F81細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的RNA，于上述選擇的適宜循環(huán)參數(shù)下進(jìn)行 RT-LAMP擴(kuò)增，判斷其特異性。

1.3.3 LAMP結(jié)果可視化效果檢測(cè):分別以 CDV GN株和蒸餾水作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，對(duì)63份臨床樣本在最佳LAMP條件下進(jìn)行檢測(cè)，以瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果為參照，觀察SYBR green I染色的可視化效果。瓊脂糖凝膠電泳:10 μL LAMP產(chǎn)物，以1.5%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，成像、觀察。SYBR green I染色:按照1∶100的比例向 LAMP反應(yīng)管中加入 SYBR green I，靜置觀察。

1.4 與RT-PCR診斷方法的比較和應(yīng)用

對(duì)63份臨床送檢的不同種類(lèi)的病料應(yīng)用RTLAMP、RT-PCR［5］方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者的符合率和檢出率的高低，初步判定RT-LAMP方法臨床使用效果。

表1 RT-LAMP引物序列Tab.1 Sequence of each primer for CDV RT-LAMP

2 結(jié)果

2.1 RT-LAMP檢測(cè)方法的建立

以CDV GN株DNA為模板，分別以60℃、63℃和65℃反應(yīng)60 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示在60℃時(shí)該實(shí)驗(yàn)的條帶清晰、分辨率較高(圖1)。在60℃，分別反應(yīng)30 min、45 min和60 min，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，表明在45 min、60 min即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)選擇60 min以提高反應(yīng)的靈敏度(圖2)。

圖1 CDV GN株的RT－LAMP反應(yīng)在不同溫度的擴(kuò)增結(jié)果M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000;1.65℃;2.63℃;3.60℃ .Fig.1 RT-LAMP products amplified at different temperaturesM.DNA marker DL2000;1.65℃;2.63℃;3.60℃.

圖2 CDV GN株的RT－LAMP反應(yīng)在不同時(shí)間的擴(kuò)增結(jié)果M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL2000;1.60min;2.45min;3.30min;4.陰性對(duì)照Fig.2 RT-LAMP products amplified at different time pointsM.DNA marker DL2000;1.60 min;2.45 min;3.30 min;4.Negative control

2.2 RT-LAMP反應(yīng)特異性試驗(yàn)

分別以CDV GN株、CPIV GN株和蒸餾水對(duì)照DNA為模板，在60℃反應(yīng)60 min，產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，CDV對(duì)照的陽(yáng)性條帶明顯，CPIV GN株和蒸餾水對(duì)照均未出現(xiàn)準(zhǔn)確條帶，表明RT-LAMP反應(yīng)特異 (圖3)

圖3 CDV RT-LAMP反應(yīng)的特異性擴(kuò)增結(jié)果M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1.陰性對(duì)照;2.CPIV GN株;3.CDV GN株.M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL2000;Fig.3 RT-LAMP specific amplified products of CDV1.negative control;2.CPIV GN strain;3.CDV GN strain

2.3 RT-LAMP方法的可視化效果

LAMP反應(yīng)結(jié)束后在產(chǎn)物內(nèi)加入1∶100稀釋的SYBR Green I，肉眼可見(jiàn)CDV RT-LAMP反應(yīng)陽(yáng)性管顏色變綠，而陰性對(duì)照管顏色仍為橙黃色，顏色變化明顯。對(duì)63份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，SYBR Green I染色判定的陽(yáng)性檢出率和陰性檢出率與電泳法相比符合率均為100%，可視化判定操作簡(jiǎn)單、效果良好。此方法可作為RT-LAMP方法現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的判定標(biāo)準(zhǔn)，不必經(jīng)過(guò)電泳、凝膠成像等繁瑣的步驟和儀器。

2.4 RT-LAMP方法的應(yīng)用結(jié)果

對(duì)63份疑似CDV感染的病料進(jìn)行RT-PCR和RT-LAMP檢測(cè)，RT-PCR總體檢出率為(40/63)63.5%，RT-LAMP方法的陽(yáng)性檢出率為(45/63)71.4%;其中，對(duì)23份結(jié)膜拭子和7份血清樣品，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果完全相同，18份肺臟樣品 RTPCR檢測(cè)出8份陽(yáng)性，RT-LAMP方法檢測(cè)出12份陽(yáng)性，15份鼻拭子中RT-PCR檢測(cè)出7份陽(yáng)性，RTLAMP方法檢測(cè)出8份陽(yáng)性。說(shuō)明 RT-LAMP方法的檢出率更高，不易出現(xiàn)假陰性結(jié)果(表2)。

表2 CDV RT-LAMP方法和RT-PCR方法的應(yīng)用比較Tab.2 Comparison between RT-LAMP and RT-PCR in clinical diagnosis

3 討論

近年來(lái)，CDV的自然感染宿主已由傳統(tǒng)的犬科(Canidae family)、鼬科(Mustelidae family)及浣熊科(Procyonidae family)擴(kuò)展到了食肉目(Carnivora oder)所有8個(gè)科及偶蹄目豬科(Suidae family)、靈長(zhǎng)目獼猴屬(Macaca Lacepede)和鰭足目海豹科(Phocidae family)等多種動(dòng)物，并且免疫動(dòng)物爆發(fā)犬瘟熱的病例在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都有報(bào)道。這些日趨復(fù)雜的臨床癥狀給CDV的診斷帶來(lái)一定難度。僅根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、包涵體檢查和病毒分離等常規(guī)方法很難確診CDV感染。因此國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者建立了 RT-PCR、巢式 PCR、套式 PCR、原位雜交、原位雜交與RT-PCR結(jié)合等多種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，但是對(duì)于CDV而言，不同種類(lèi)、不同病理階段的檢測(cè)材料對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響存在在很大差異，上述各種檢測(cè)方法在應(yīng)用中均有其不足之處。Doo KIM等應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)人工感染犬在不同病理時(shí)期采集的樣本進(jìn)行了檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)，證實(shí)不同時(shí)期采集的外周血、結(jié)膜拭子、鼻拭子、尿液的檢出率差別很大，在攻毒后連續(xù)采樣20 d中，前2 d采集的鼻拭子和外周血中檢測(cè)不到CDV，前5 d內(nèi)采集的尿液中檢測(cè)不出CDV，而結(jié)膜拭子從第1天到第20天均能達(dá)到100%的檢出率(7/7)，證實(shí)了采樣部位和采樣時(shí)機(jī)對(duì)RT-PCR結(jié)果的重要影響［6］。Frisk等基于 NP基因設(shè)計(jì)了 3對(duì)不同引物，研究不同引物對(duì)的檢出率的影響，在29個(gè)病毒陽(yáng)性病例中，三對(duì)引物的檢出率分別為82%、53%、41%，分析認(rèn)為RT-PCR的敏感性受到所選引物的影響，取決于擴(kuò)增片段的位置，而且由于病程和發(fā)病類(lèi)型的不同病毒的分布會(huì)有很大差異，同樣會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。因此，在一個(gè)病例中選擇多種樣本(血清、外周血、鼻拭子、腦脊髓液)或者采取不同時(shí)間的多個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)能夠顯著提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性［7］。

無(wú)論是檢材種類(lèi)的不同、采樣時(shí)間的差別、還是RNA降解的影響，犬瘟熱病毒檢測(cè)時(shí)存在假陰性的一個(gè)重要原因，是受到檢測(cè)方法本身靈敏度的限制，導(dǎo)致當(dāng)病毒(或其RNA)低于某個(gè)限量的時(shí)不能檢出。要進(jìn)一步提高CDV的檢測(cè)準(zhǔn)確性，就必需采用具備更高靈敏度核酸檢測(cè)技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近些年開(kāi)發(fā)的一種簡(jiǎn)單、迅速、特異且具成本效益的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)［8］，它利用4條不同引物識(shí)別6個(gè)不同區(qū)域的靶基因，在恒溫條件(約60～65)0C能夠通過(guò)一步反應(yīng)在15 min～60 min內(nèi)將DNA擴(kuò)增109～1010倍，其靈敏度被證明是常規(guī)PCR 的 10－100 倍［9－12］。鑒于 LAMP 技術(shù)在靈敏度上的優(yōu)勢(shì)，本文建立了檢測(cè)犬瘟熱病毒的RTLAMP方法，經(jīng)體系優(yōu)化后，證實(shí)該方法可在60℃等溫的條件下、1 h內(nèi)完成擴(kuò)增，且對(duì)感染犬類(lèi)的其他病毒不出現(xiàn)非特異性反應(yīng);對(duì)63份臨床可疑樣本的檢測(cè)結(jié)果證明，該RT-LAMP方法陽(yáng)性檢出率高于RT-PCR方法，能夠減少的臨床檢測(cè)中假陰性的比例;另外，與常規(guī)PCR方法相比，LAMP技術(shù)獨(dú)特的可視化的結(jié)果判定方法和檢測(cè)時(shí)間上的優(yōu)勢(shì)，也大大增加了將之應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的前景。但與其高超的靈敏度相對(duì)應(yīng)，LAMP方法的假陽(yáng)性也是一個(gè)爭(zhēng)論的焦點(diǎn)，尤其檢測(cè)大批量樣本時(shí)陽(yáng)性產(chǎn)物產(chǎn)生的氣溶膠是造成假陽(yáng)性的重要原因，在本文中由于臨床送檢樣本中內(nèi)容物有限，不足以對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行假陽(yáng)性驗(yàn)證，因此僅對(duì)水貂肺臟樣本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)(另文發(fā)表)，證實(shí)了LAMP檢測(cè)陽(yáng)性而RT-PCR陰性的5份病料中可見(jiàn)典型的犬瘟熱病毒核內(nèi)包涵體，之所以RT-PCR檢測(cè)陰性，可能是病料運(yùn)送過(guò)程較長(zhǎng)或者大量的內(nèi)源性RNA酶在RNA提取過(guò)程中導(dǎo)致了核酸的降解，超出了RT-PCR方法的檢測(cè)下限，這在相關(guān)研究已有提及［6］。

綜上，本研究針對(duì)犬瘟熱病毒建立的RT-LAMP檢測(cè)方法，靈敏、迅速、特異性強(qiáng)，無(wú)需使用昂貴的儀器設(shè)備，具備可視化判定結(jié)果的能力，可作為一種高效檢測(cè)CDV的手段，廣泛應(yīng)用于CDV的診斷和流行病學(xué)調(diào)查等相關(guān)研究。

［1］Soma T， Ishii H， Hara M， et al. Comparison of immunoperoxidase plaque staining and neutralizing tests for canine distemper virus［J］.Vet Res Commun，2001，25(4):311－325.

［2］Appe IMJ，Yates RA，F(xiàn)oley GL，at al. Canine distemper epizootic in lions，tigers，and leopards in North America［J］.J Vet Diagn Invest，1994.6:277－288.

［3］Hoyland JA，Dixon JA，Berry JL，et al.A comparison of in situhybridization，reverse transcripitase-polymerase chain reaction(RT-PCR)and in situ-RT-PCR for detection of canine distemper virus RNA in Paget’s disease［J］.J Virol Methods，2003.109(2):253－259.

［4］Jozwik A，F(xiàn)rymus T.Comparison of the immunofluorescence assay with RT-PCR and nested PCR in the diagnosis of canine distemper［J］.Vet Res Commun，2005，29(4):347－359.

［5］肖定福，張匯東，李文平，等.RT-PCR檢測(cè)寵物犬的犬瘟熱病毒［J］.經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，9(4):221－224.

［6］Frisk AL，Konig M，Moritz A，at al.Detection of canine distemper virus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum，whole blood，and cerebrospinal fluid from dogs with distemper［J］.J Clin Microbiol，1999，37:3634－3643.

［7］Doo KIM，Jeoung SY，So-Jeo AHN，at al.Comparison of tissue and fluid samples for the early detection of canine distemper virus in experimentally infected dogs［J］.J.Vet Med Sci，2006，68(8):877－879.

［8］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et.al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28(12):E63.

［9］Cho HS，Kang JI，Park NY.Detection of canine parvovirus in fecal samples using loop-mediated isothermal amplification［J］.J Vet Diagn Invest，2006，18(1):81－84.

［10］Imai M，Ninomiya A，Minekawa H.Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed in fluenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method［J］.Vaccine，2006，24(44－46):6679－6682.

［11］Poon LL，Wong BW，Ma EH，et.al.Sensitive and inexpensive molecular test for falciparum malaria: detecting Plasmodium falciparum DNA directly from heat-treated blood by loopmediated isothermal amplification［J］.Clin Chem，2006，52(2):303－306.

［12］Pham HM， Nakajima C， Ohashi K， et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Newcastle disease virus［J］.J Clin Microbiol，2005，43(4):1646－1650.

Detection of Canine Distemper Virus by Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification Method

WEN Hai，QIN Hai-bin，HE Xing-liang，ZHU Qian，GAO Yi-long，ZHANG Hui-dong
(Nanjing Policedog Research Institute of MPS，Nanjing 210012，China)

Objective To develop a new method for rapid detection of canine distemper virus by reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification method(RT-LAMP).Method According to the published GenBank sequence，four strips of primers specific recognizing NP gene of canine distemper virus were designed.We studied the optimal reaction conditions，specificity，sensitivity，and its visualized judging method of products.Then we used 63 clinical specimens to verify its efficiency in field detection.Results The amplication can be performed at a constant temperature 60℃ within 1 hour.Specific primers did not recognize genes of other virus commonly infecting canine.The results of RTLAMP could be easily observed by naked eyes after SYBR green I staining.In 63 specimens collected from Nanjing and Shangdong，45 samples(71.4%)were positive，but only 40 samples(63.5%)were positive using RT-PCR.Conclusion The results of our study demonstrate a higher superiority of specificity，sensitivity，efficiency and convenience of the RTLAMP method，and provide a new detection method for canine distemper virus.

RT-LAMP;canine distemper virus，CDV

S852.65+5;S858.292;R33

A

1671-7856(2012)08-0051-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.012

2012-05-24

公安部應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃(2007YYCXNJJQS161)。

溫海(1961－)，男，副研究員，從事動(dòng)物疫病防控工作。E-mail:hingull@sina.com。

張匯東，研究員，E-mail:zhhuido@163.com。