劉 洋，孫建寧，董世芬，劉 明，張 易，張碩峰

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 100102;2.貴陽中醫(yī)學院，貴陽 550002)

永久性局灶性中動脈阻斷腦缺血(pMCAO)模型大鼠腦內(nèi)突觸相關蛋白表達的免疫組織化學觀察

劉 洋1，孫建寧1，董世芬1，劉 明2，張 易1，張碩峰1

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 100102;2.貴陽中醫(yī)學院，貴陽 550002)

目的 觀察永久性局灶性中動脈阻斷腦缺血(pMCAO)模型大鼠腦缺血發(fā)作后2 d、7 d腦內(nèi)突觸相關蛋白表達的變化。方法 制作大鼠永久性局灶性中動脈阻斷腦缺血(pMCAO)模型。缺血動物術后隨機分為缺血2 d組、缺血7 d組，另設假手術組。在術后2 d、7 d 2個時間點采用HE染色觀察動物神經(jīng)病理學改變，同時采用免疫組織化學法觀察動物的缺血側腦組織突觸素－I(synapsin－I)、突觸后致密蛋白95(PSD－95)、α－突觸核蛋白(αsynuclein)表達情況。結果 與假手術組相比，缺血后，模型動物神經(jīng)元大量變性壞死，數(shù)目減少，排列散亂。缺血后 2 d，synapsin－I在 CA1區(qū)、CA3區(qū)、皮層表達顯著減少(P＜0.05或 P＜0.01)，PSD－95在 CA1區(qū)、皮層表達顯著減少(P＜0.05或 P＜0.01)，α－synuclein在 CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生顯著積聚(P＜0.01);缺血后 7 d，synapsin－I在 CA1區(qū)、皮層表達仍顯著降低(P＜0.01)，PSD－95在CA1區(qū)、皮層表達顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)，α－synuclein在CA1、CA3、皮層表達顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)。結論 pMCAO模型大鼠在腦缺血發(fā)生后，神經(jīng)突觸有關蛋白的表達顯著改變，并隨缺血后不同時間點表達情況不同，這可能與神經(jīng)元突觸重塑有關。突觸相關蛋白的表達與缺血損傷程度密切相關。

永久性局灶性中動脈阻斷腦缺血模型;突觸素－Ⅰ;突觸后致密蛋白95;α－突觸核蛋白

1 引言

腦缺血是一種具有高致死率和致殘率的疾病，隨著目前人類社會進入老齡化社會，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，已經(jīng)成為威脅人類生命健康的疾病之一［1］。腦缺血發(fā)病機制復雜，其病理過程涉及鈣超載、氧化應激、炎癥級聯(lián)反應、興奮性氨基酸毒性等，最終導致神經(jīng)元細胞凋亡。突觸是神經(jīng)元進行信息傳遞的特殊結構，其數(shù)目、結構、功能與神經(jīng)系統(tǒng)生理、病理狀態(tài)密切相關［2］。近年來相關研究表明，神經(jīng)元突觸對缺血性損傷極為敏感［3］。神經(jīng)元的凋亡、再生和突觸重塑等形態(tài)學改變與神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關，可導致神經(jīng)網(wǎng)絡功能的重建。缺血性損傷會導致神經(jīng)系統(tǒng)突觸數(shù)目、功能、結構的變化，而這種變化直接影響到神經(jīng)信息的傳遞［4］。

本研究擬采用永久性局灶性中動脈阻斷腦缺血(pMCAO)大鼠模型，觀察缺血后2 d、7 d模型動物大腦海馬、皮層與突觸功能突觸素－I(synapsin－I)、突觸后致密物蛋白質(zhì) 95(PSD－95)、α－突觸核蛋白(α－synuclein)表達變化情況，以期研究腦缺血后神經(jīng)元突觸病理改變，為改善突觸功能、促進神經(jīng)系統(tǒng)功能重建及相關藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 藥品與試劑

試劑:兔抗大鼠 synapsin－I多克隆抗體(批號，20110629)、兔抗大鼠 PSD－95多克隆抗體(批號，20110528)、兔抗大鼠 α－syn多克隆抗體(批號，20110610)、由北京博奧森公司提供;多聚甲醛，由sigma公司(美國)提供。

2.2 主要儀器

Olympus BX51顯微鏡;Olympus E330數(shù)碼照相機;Image－pro 5.0圖像分析系統(tǒng)。

2.3 實驗動物分組及處理

SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250～270 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號:［SCXK(京)2006－0009］，按照實驗動物 3R 原則給予人道關懷。大鼠于室溫(22～25)℃，相對濕度65%，12 h明暗交替環(huán)境中適應2周進入實驗。參照Koizumi和 Nagasawa方法及改良 MCAO制作方法稍加改進制作pMCAO模型［5－7］。大鼠采用10%水合氯醛(0.35mL/100 g體重)麻醉后，仰臥固定。剪開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露并分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。結扎ECA與CCA近心端，用動脈夾夾閉ICA遠心端，于ECA與ICA分叉處作一小切口，插入頭端加熱成光滑球形的釣魚尼龍線(直徑為0.261mm)，插入深度為18－19mm左右，實現(xiàn)右側大腦中動脈阻塞導致腦缺血。結扎切口處，剪掉血管外的尼龍線，縫合皮膚。假手術組動物不栓塞大腦中動脈，其余處理同模型組。

術后6 h，待動物清醒后，按照 Longa 5級評分法［8］，對動物進行神經(jīng)功能行為評分，評分標準:無明顯神經(jīng)癥狀，0分;不能完全伸展左側前爪，1分;向左側旋轉(zhuǎn)，2分;行走時向左側傾倒，3分;不能自行行走，4分。選取評分為1～3分的動物入選后續(xù)實驗，并隨機分成2組:缺血2 d組、缺血7 d組。另設假手術組。

2.4 蘇木素-伊紅染色(H＆E staining)

分別于造模后2 d、7 d，麻醉大鼠，開胸，用預冷的0.9%生理鹽水200mL經(jīng)左心室快速沖洗，繼用4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)400mL灌流固定。腦組織以4%多聚甲醛固定液(pH 7.4)固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，每組取3例，取視交叉前后2mm組織塊(包含缺血周圍區(qū))，冠狀位連續(xù)切片，片厚5 μm，進行 HE染色，觀察造模后動物腦組織病理學改變。采用Olympus BX51型正置顯微鏡觀察HE切片，在20×10倍數(shù)下于缺血側CA1、CA3、皮層缺血區(qū)域周圍選取3個視野，采用Olympus E330數(shù)碼相機采集圖像，Image－Pro Plus 5.0軟件對圖像進行分析。觀察缺血側神經(jīng)元損傷情況。

2.5 免疫組織化學染色觀察腦組織 PSD-95、synapsin-I、α-synuclein 蛋白表達

常規(guī)石蠟切片，免疫組織化學法觀察腦組織synapsin－I、PSD－95、α－synuclein 蛋白表達，基本方法如下:切片常規(guī)脫蠟，PBS漂洗5 min×3次，微波抗原修復20 min，PBS漂洗5 min×3次，過氧化氫處理 30 min，PBS 漂洗 5 min× 3 次，滴加 synapsin－I、PSD－95 或 α－synuclein 抗體 50 μL(1:50)，在暗濕盒中(37℃)孵育2 h，PBS漂洗5 min×3次，滴加山羊抗兔 IgG 50 μL，在暗濕盒中(37℃)孵育 2 h，PBS漂洗5 min×3次，DAB(1:50)控制顯色，蒸餾水洗滌終止顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Olympus BX51型正置顯微境觀察染色切片，在20×10倍數(shù)下于缺血側 CA1、CA3、皮層缺血區(qū)域周圍選取 3個視野，采用Olympus E330數(shù)碼相機采集圖像，Image－pro Plus 5.0軟件對免疫組化結果進行分析。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)以±s表示，P ＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 病理圖像分析

假手術組動物皮層神經(jīng)元細胞圓整神經(jīng)元胞質(zhì)豐富，色淡，細胞核居中，核仁清晰;海馬神經(jīng)元排列密集整齊，形態(tài)圓整，體積較大，偶見壞死神經(jīng)元。與假手術組動物相比，術后2 d，模型組光鏡下腦組織出現(xiàn)明顯液化現(xiàn)象，皮層神經(jīng)元大量變性壞死，表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)目減少、排列紊亂，胞膜輪廓不清，細胞核固縮深染;海馬神經(jīng)元排列散亂，神經(jīng)元變形，核不規(guī)則，變性神經(jīng)元核固縮深染、且神經(jīng)元數(shù)目減少。(圖1見彩插2)。術后7 d，與假手術組相比，模型組皮層部位神經(jīng)元損傷嚴重，神經(jīng)元數(shù)目減少，完整神經(jīng)元大量缺失，可見大量空泡和液化灶;海馬區(qū)域神經(jīng)元排列紊亂，可見大量變性神經(jīng)元細胞，核深染固縮。(圖2見封三)。

3.2 免疫組化結果

3.2.1 pMCAO模型大鼠腦內(nèi) synapsin－I表達的變化:缺血2 d后，與假手術組相比，模型組動物腦內(nèi)海馬 CA1區(qū)沒有顯著差別，但在 CA3區(qū)、皮層 Syn－I明顯下降(P＜0.05)。缺血7 d后，與假手術組相比，模型組海馬CA1區(qū)、皮層Syn－I表達仍顯著降低(P＜0.01)，CA3區(qū)表達略有上升。結果見表1。

表1 pMCAO模型大鼠腦內(nèi)synapsin－I表達的變化(±s)Tab.1Expression of synapsin－I in the brain of pMCAO model rats(±s)

表1 pMCAO模型大鼠腦內(nèi)synapsin－I表達的變化(±s)Tab.1Expression of synapsin－I in the brain of pMCAO model rats(±s)

注:與假手術組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01Note:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.the sham group.

組別2d Cortex假手術組 Sham 1072.35±119.11 1192.75±304.82 1162.73±293.43 1181.16±207.62 1267.39±337.04 1177 Groups 7 d CA1區(qū)CA1 Region CA3區(qū)CA3 Region 皮層Cortex CA1區(qū)CA1 Region CA3區(qū)CA3 Region 皮層.56±305.75模型組Model 818.31±87.97＊＊ 834.55±146.85* 528.94±239.02* 841.87±230.82＊＊ 1109.92±447.03 362.17±248.12＊＊

3.2.2 pMCAO模型大鼠腦內(nèi)PSD－95表達的變化:術后2 d，與假手術組相比，模型組海馬 CA1區(qū)、皮層PSD－95的表達顯著下降(P＜0.01)。缺血后 7 d，與假手術相比，模型組在在CA1區(qū)表達降低(P＜0.05)、CA3區(qū)表達略有上升，但與假手術組相比差異無顯著性，皮層區(qū)PSD－95表達仍顯著低于假手術組(P＜0.01)。結果見表2。

表2 pMCAO模型大鼠海馬、皮層PSD－95表達的影響(±s)Tab.2Expression of PSD－95 in the brain of pMCAO model rats(±s)

表2 pMCAO模型大鼠海馬、皮層PSD－95表達的影響(±s)Tab.2Expression of PSD－95 in the brain of pMCAO model rats(±s)

注:與假手術組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01Note:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.the sham group

組別2d Cortex假手術組 Sham 1632.42±203.00 956.79±489.84 1474.49±345.62 1231.34±239.69 1080.11±178.72 1304.Groups 7 d CA1區(qū)CA1 Region CA3區(qū)CA3 Region 皮層Cortex CA1區(qū)CA1 Region CA3區(qū)CA3 Region 皮層90±333.33模型組 Model 880.19±340.30＊＊ 776.82±300.16 296.12±132.31＊＊909.80±365.53* 1168.16±510.91 374.92±129.52＊＊

3.2.3 pMCAO模型大鼠腦內(nèi) α－synuclein表達的變化:術后48 h，與假手術組相比，模型組腦內(nèi) αsynuclein在海馬CA1區(qū)表達顯著增加(P＜0.01)，CA3區(qū)、皮層表達有所上升，但尚無顯著性差異。缺血后7 d，與假手術相比，α－synuclein在 CA1區(qū)、皮層表達顯著增加(P＜0.01)，CA3區(qū)表達也有明顯增加(P＜0.05)。結果見表3。

表3 pMCAO模型大鼠海馬、皮層α－synuclein表達的影響(±s)Tab.3Expression of α－synuclein in the brain of pMCAO model rats(±s)

表3 pMCAO模型大鼠海馬、皮層α－synuclein表達的影響(±s)Tab.3Expression of α－synuclein in the brain of pMCAO model rats(±s)

注:與假手術組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01Note:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.the sham group

組別2d Cortex假手術組 Sham 1013.20±240.11 849.87±163.71 887.17±385.45 799.14±223.72 702.78±130.73 714.97±2 Groups 7 d CA1區(qū)CA1 Region CA3區(qū)CA3 Region 皮層Cortex CA1區(qū)CA1 Region CA3區(qū)CA3 Region 皮層20.45模型組Model 1406.57±232.05＊＊ 985.00±232.38 1111.31±261.45 1121.49±215.71＊＊ 905.99±166.61* 1268.48±344.38＊＊

4 討論

pMCAO模型是常用的腦缺血動物實驗模型，其制作方法經(jīng)過不斷改良與優(yōu)化［9］，目前已經(jīng)較為成熟，具有方法簡單、成功率高、重復性好的特點。目前應用較為廣泛，適用于觀察缺血后病理改變及評價相關治療藥物的療效［10，11］。

突觸結構是大腦神經(jīng)元間進行神經(jīng)信息傳遞的物質(zhì)結構基礎。作為神經(jīng)系統(tǒng)的重要結構單位，突觸的數(shù)量及其結構完整性對維持大腦功能的正常發(fā)揮起到了至關重要的作用。近些年來，腦缺血發(fā)生后突觸結構和功能改變?nèi)找媸艿街匾?。有研究顯示，皮層突觸重塑與運動功能恢復在時間上具有一致性。這說明突觸重塑能夠為神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復提供重要信息［12］。

目前，已有大量研究表明突觸相關蛋白與腦缺血密切相關。其中，關于PSD－95的研究較為豐富。PSD－95 是突觸后致密物質(zhì)(post－synaptic density，PSD)中的一個主要蛋白，在腦組織內(nèi)廣泛分布，其在介導和整合突觸信號傳遞過程起到了重要作用［13］。研究表明其直接參與了缺血信號的轉(zhuǎn)導，對突觸功能和神經(jīng)元的存活具有明顯影響，PSD的改變直接影響突觸的傳遞功效［14－16］。缺血引起的PSD95及其相關蛋白特性改變的機制是復雜和多方面的，包括突觸后細胞 Ca2+濃度改變、去磷酸化反應、蛋白酶激活、氧化反應和其他改變等，有助于神經(jīng)細胞興奮性增強而導致細胞死亡［17］。這表明PSD95的調(diào)控作用對突觸功能和神經(jīng)元的存活有明顯的作用。本研究中，腦缺血后2 d，不同腦區(qū)PSD－95表達明顯下降，其中CA1區(qū)、皮層最為明顯。缺血后7 d，與假手術組相比，模型組 CA1區(qū)、皮層表達仍較低，在CA3表達略有升高，這可能與突觸重建有關。

Synapsin－I屬于囊泡膜蛋白，其參與到囊泡轉(zhuǎn)運、神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)等重要生理過程，其表達狀態(tài)也能夠反應突觸功能［18，19］。研究表明，其與突觸重建密切相關。有研究表明，短暫腦缺血后Synapsin－I會有短暫降低，與神經(jīng)元凋亡在時間上具有同步性，提示腦缺血后存在的失神經(jīng)和神經(jīng)再獲現(xiàn)象可能與 DNA的損傷和修復有關［20］。本研究中，在缺血 2 d后，與假手術組相比，Synapsin－I在CA3區(qū)、皮層的表達都明顯下降，這提示腦缺血急性期，突觸功能受到損傷，囊泡轉(zhuǎn)運能力下降。

α－synuclein近些年來受到廣泛的關注，其在神經(jīng)退行性疾病中的作用逐漸受到重視［21］。因其是組成Lewy體的主要蛋白之一，其在帕金森和阿爾茲海默癥中的作用尤其受到廣泛關注，但在腦缺血病理改變中的作用研究尚不深入［21，22］。但相關研究表明，α－synuclein 對神經(jīng)細胞具有毒性［23］。其聚集和過度表達損傷神經(jīng)元，引起神經(jīng)元變性，從而影響突觸功能。缺血再灌注損傷發(fā)生后，α－synuclein腦內(nèi)積聚，不利于神經(jīng)元存活［24］。本研究觀察了α－synuclein在腦缺血發(fā)生后不同時間點的表達情況。結果表明缺血后2 d，α－synuclein即在 CA1區(qū)、皮層顯著增加，這種差異一直持續(xù)到第7 d。缺血至第7 d時，除CA1區(qū)、皮層以外，其在CA3區(qū)的表達也顯著增加。這表明在觀察期內(nèi)，隨著缺血時間的延長，α－synuclein在神經(jīng)元的積聚增加，截至觀察期(7 d)結束，其在CA1區(qū)、CA3區(qū)和皮層的表達均顯著增加。

綜上所述，缺血后2 d，與假手術組相比，模型組不同腦區(qū)神經(jīng)元突觸均受到缺血性損傷，表現(xiàn)為PSD－95、synapsin－I表達水平下降以及 α－synuclein 的積聚;缺血后 7 d，盡管 PSD－95 和 synapsin－I表達水平較2 d略有升高，但仍舊顯著低于假手術組表達水平，且α－synuclein表達水平高于假手術，這表明，截至到缺血后7 d，突觸功能尚沒有完全恢復。值得注意的是，缺血損傷發(fā)生后，腦內(nèi)突觸功能存在重建過程［25，26］，許多因素可以增加突觸相關功能蛋白的表達，促進突觸功能的恢復。

近年來突觸功能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關系日益受到關注，改善突觸功能、增強突觸傳遞將為疾病的治療提供新的思路和方法。了解疾病發(fā)生后突觸功能的改變，對關鍵蛋白、基因表達進行干預，或可以保護神經(jīng)元，減輕缺血性損傷。在今后的研究中，應考慮延長觀察時間，從而更為全面地觀察腦缺血發(fā)生后突觸相關蛋白的表達動態(tài)，以評價突觸重建與缺血時間的關系，為藥物干預時間窗的確定提供數(shù)據(jù)支持。

［1］van Walraven C，Hart RG，Connolly S，et al.Effect of age on stroke prevention therapy in patients with atrial fibrillation－the atrial fibrillation investigators［J］.Stroke，2009，40:1410－1416.

［2］Janz R，Sudhof TC，Hammer RE，et al.Essential roles in synaptic plasticity for synaptogyrin I and synaptophysin I［J］.Neuron，1999，24(3):687－700.

［3］Bolay H，Gursoy Ozdemir Y，Sara Y.Persistent defect in transmitter releaseand synapsin phos phorylation in cerebral cortex after transient moderate ischemic injury［J］.Stroke，2002，33(5):1369－1375.

［4］王慧娟，蘇麗英，李陳莉，等.大鼠腦缺血后突觸體素與突觸密度的關系［J］.解剖學雜志，2004，27(6):642－645.

［5］Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al.Experimental studies of ischemic brain edema:a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced［J］.Stroke，1986，8:1－8.

［6］Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke，1989，20(8):1037－1043.

［7］許金秀，楊牧，周紅.大鼠永久性大腦中動脈阻塞模型的建立［J］.四川動物，2010，29(3):461－466.

［8］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke，1989，20:84－91.

［9］辛世萌，劉遠洪，聶志余，等.栓線長度、直徑、及大鼠體重與栓線法大鼠局灶性腦缺血模型關系的研究［J］.大連醫(yī)科大學學報，2000，22(2):105－107.

［10］Roof RL，Schielke GP，Ren XD，et al.A comparison of longterm functional outcome after 2 middle cerebral artery occlusion models in rats［J］.Stroke，2001，32:2648－2657.

［11］劉明，孫建寧，董世芬，等.梓醇對永久性腦缺血損傷大鼠恢復早期運動感覺功能和能量代謝的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2011，34(4):245－249.

［12］張翠玲，劉立，任宇虹，等.腦缺血性損傷后的皮層突觸再生與運動功能恢復［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2001，22(12):1122－1147.

［13］Craven SE，Bredt DS.PDZ proteins organize synaptic signaling pathways［J］.Cell，1998，93:495－498.

［14］Gardoni F，Schrama LH，Kamal A，et al.Hippocampal synaptic plasticity involves competition between Ca2+/calmodulindependent protein kinase II and postsynaptic density 95 for binding to the NR2A subunit of the NMDA receptor［J］.J Neuro Sci，2001，21:1501－1509.

［15］Martone ME，Jones YZ，Young SJ，et al.Modification of postsynaptic densities after transient cerebral ischemia: a quantitative and three dimensional ultrastructural study［J］.J Neurosci，1999，19(6):1988－1997.

［16］Hu BR，Park M，Martone ME，et al.Assembly of proteins to postsynaptic densities after transient cerebral ischemia［J］.J Neurosci，1998，18(2):625－633.

［17］Takagi N，Logan R，Teves L，et al.Altered interaction between PSD 95 and the NMDA receptorfollowingtransientglobal ischemia［J］.J Neurochem，2000，74(1):169－178.

［18］Stroemer RP，Kent TA，Hulsebosch CE.Enhanced neocortical neural sprouting，synaptogenesis，and behavioral recovery with D－amphetamine therapy after neocortical infarction in rats［J］.Stroke，1998，29:2381－2393.

［19］梁燕玲，張?zhí)K明，許康.短暫腦缺血再灌注后突觸蛋白Ⅰ表達與細胞凋亡［J］.中國臨床康復，2005，9(37):54－56.

［20］Al－Wandi A，NInkina N，Millership S，et al.Absence of α－synuclein affects dopamine metabolism and synaptic markers in the striatum of aging mice［J］.Neurobiol Aging，2010，31:796－804.

［21］Baba M，Nakajo S，Tu PH，et al.Aggregation of alphasynuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies［J］.Am J Pathol，1998，152:879－884.

［22］Hashimoto M，Rockenstein E，Crews L，et al.Role of protein aggregation in mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer‘s and Parkinson ’s disease［J］.Neuromolec Med，2003，4:21－35.

［23］Forloni G， BertaniI， CalellaAM， et al.Alpha－syn and Parkinson’s disease:selective neurodegenerative effect of alphasyn fragment on dopaminergic neurons in vitro and in vivo［J］.Ann Neurol，2000，47(5):632－640.

［24］Isin Unal－Cevik，Yasemin Gursoy－Ozdemir，Muge Yemisci，et al.Alpha－synuclein aggregation induced by brie fischemia negatively impacts neuronal survival in vivo:a study in［A30P］alpha－synuclein transgenic mouse［J］.J Cerebr Blood Met，2011，31:913－923.

［25］劉罡，吳毅，胡永善，等.跑臺訓練對腦缺血大鼠腦組織超微結構及突觸素表達的影響［J］.中國康復醫(yī)學雜志，2008，23(10):872－874.

［26］葉靈靜，徐曉虹，王亞民，等.豐富環(huán)境對腦缺血大鼠突觸界面結構修飾和PSD－95基因表達的影響［J］.心理學報，2008，40(6):709－716.

Immunohistochemical Observation of Brain Synaptic Proteins in the Rat Models of Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion(pMCAO)

LIU Yang1，SUN Jian－ning1，DONG Shi－fen1，LIU Ming2，ZHANG Yi1，ZHANG Shuo－feng1
(1.School of Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China;2.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 100102)

Objective To observe synaptic protein expressions in the brain of permanent middle cerebral artery occlusion(pMCAO)model rats on 2 and 7 after ischemic attack.Methods To establish a rat model of pMCAO.The rats with ischemia were randomly divided into 2－day group and 7－day group，taking rats with no occlusion as the sham group.On d 2 and d 7 post－operation，pathological changes in ischemic brain tissue were observed with H＆E staining，and expression of synapsin－I，postsynaptic density protein 95(PSD－95)，α－synuclein were examined with immunohistochemical staining.Results Compared with the sham group，there were a large amount of neurons lost，and degeneration and necrosis of scattered neurons in the brain tissue in the model group.On the 2ndday post－ischemia，in the model group，expressions of synapsin－I in the CA1 and CA3 regions and cortex were significantly reduced(P ＜0.05 or P ＜0.01)，PSD－95 in CA1 region and cortex was significantly reduced(P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01)，while α－synuclein in CA1 region significantly accumulated(P ＜0.01).On the 7thday after ischemia，in the model group expression of synapsin－I in CA1 region and cortex were still significantly reduced(P ＜0.01)，PSD－95 in CA1 region and cortex also significantly reduced(P ＜0.05 or P ＜0.01)，and α－synuclein in CA1，CA3 regions and cortex was significantly increased(P ＜0.05 or P ＜0.01).Conclusions In the brain tissue of pMCAO model rats，expression of synaptic proteins is significantly changed and varies along with the time－course of ischemia，probably，it might be related to synapse remodeling.The expression of synapse－associated proteins is closely related to the degree of ischemic injury.

Permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO;rat model;Synapsin－I;PSD－95; α－synuclein

R743.3;R33

A

1671－7856(2012)08－0043－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.010

2012－05－09

A：假手術組-CA1區(qū) B：假手術組-CA3區(qū) C：假手術組-皮層D：模型組-CA1區(qū) E：模型組-CA3 F：模型組-皮層
圖1 大鼠HE染色病理學觀察（缺血后2 d）
Note: A: Sham group - CA1; B: Sham group - CA3; C: Sham group - cortex;D: pMCAO group - CA1; E: pMCAO group - CA3; F: pMCAO group - cortex.
Fig.1 Histopathological changes of the brain tissue at 2 days post-occlusion (HE staining).

G：假手術組-CA1區(qū) H：假手術組-CA3區(qū) I：假手術組-皮層J：模型組-CA1區(qū) K：模型組-CA3 L：模型組-皮層
圖2 大鼠HE染色病理學觀察（缺血后7 d）
Note: G: Sham group - CA1; H: Sham group - CA3; I: Sham group - cortex;J: pMCAO group - CA1; K: pMCAO group - CA3; L: pMCAO group - cortex.
Fig.2 Histopathological changes of the brain tissue in the rats at 7 days post-occlusion. HE staining

劉洋(1984－)，女，博士研究生，研究方向為中藥防治心腦血管疾病研究。E－mail:echoinapril@163.com。

孫建寧(1952－)，女，教授，博士生導師，從事中藥防治重大疾病創(chuàng)新藥物研究，E－mail:jn_sun@sina.com。