路 靜，朱祥宇，王 超，王 迎，陳振文，杜小燕

(1.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100069;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100191)

周齡和激素水平對(duì)長爪沙鼠超數(shù)排卵效果的影響

路 靜1，朱祥宇2，王 超1，王 迎1，陳振文1，杜小燕1

(1.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100069;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100191)

目的 探討不同周齡和激素水平對(duì)長爪沙鼠超數(shù)排卵效果的影響，以期確定長爪沙鼠最佳超排周齡和激素使用劑量。方法 腹腔注射10 IU PMSG/HCG對(duì)4～18周齡8個(gè)年齡段的雌性長爪沙鼠進(jìn)行超數(shù)排卵，末次注射16～17 h內(nèi)對(duì)各組動(dòng)物卵母細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定最佳超排周齡后，對(duì)該年齡動(dòng)物以5、10、15 IU3個(gè)劑量水平腹腔注射PMSG/HCG，觀察各組動(dòng)物的卵母細(xì)胞計(jì)數(shù)差異。結(jié)果 與其它周齡組相比，6周齡組長爪沙鼠超數(shù)排卵后的卵母細(xì)胞數(shù)最多，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而5、10、15IU等3個(gè)劑量組的超排效果也有一定的差異，10 IU組數(shù)量最高。結(jié)論 對(duì)長爪沙鼠而言，采用10 IU激素注射和6周齡的動(dòng)物進(jìn)行超數(shù)排卵，獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量最多而且超排效果穩(wěn)定性。

長爪沙鼠;周齡;劑量;超數(shù)排卵

長爪沙鼠，又稱蒙古沙鼠(Meriones unguiculatus，Mongolian gerbil)，屬于哺乳綱，嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬。由于其具有一些獨(dú)特的解剖學(xué)、生理學(xué)和行為學(xué)特征，是一種正在開發(fā)的，具有廣泛應(yīng)用前景的“多功能”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，目前已廣泛應(yīng)用于腦缺血、營養(yǎng)代謝、寄生蟲、藥理學(xué)、胃癌等研究領(lǐng)域，甚至在聽覺、焦慮等研究領(lǐng)域也發(fā)揮了重要作用［1－5］。但遺憾的是，國內(nèi)外對(duì)其生殖以及胚胎發(fā)育的研究均鮮有報(bào)道，這極大地桎梏了長爪沙鼠的開發(fā)和利用。為了探討長爪沙鼠穩(wěn)定高效的超排方法，獲取數(shù)量較多及質(zhì)量較高的長爪沙鼠的成熟卵母細(xì)胞，本文從影響超數(shù)排卵最重要的兩種因素年齡和激素劑量入手，對(duì)長爪沙鼠的超數(shù)排卵效果進(jìn)行研究，為開展相關(guān)的胚胎研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)長爪沙鼠40只，雌性，體重30～75 g，來自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，生產(chǎn)合格證號(hào) SCXK(京)2000－0012，飼養(yǎng)于控制溫濕度的普通環(huán)境中。

1.2 試劑

PMSG(孕馬血清促性腺激素)，HCG(人絨毛膜促性腺激素)均購西美杰公司;透明質(zhì)酸酶購自美國Sigma公司，生理鹽水，M2培養(yǎng)液，75%乙醇等。

1.3 器械

35mm塑料培養(yǎng)皿，體視顯微鏡，倒置顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，滅菌手術(shù)器械(眼科剪、眼科鑷、顯微剪和顯微鑷等)。

1.4 超數(shù)排卵實(shí)驗(yàn)過程

以年齡因素為變量的實(shí)驗(yàn)，長爪沙鼠共分為8組，分別為 4、6、8、10、12、14、16、18 周齡，每組 4 只，注射劑量為10 IU PMSG/HCG。以劑量為變量的長爪沙鼠共分為 3個(gè)組，分別為 5、10和 15 IU的PMSG/HCG。給長爪沙鼠腹腔注射 PMSG后，46～48 h內(nèi)再腹腔注射HCG，此后在16～17 h內(nèi)將長爪沙鼠頸椎脫臼處死，仰臥噴灑75%酒精，打開腹腔，分別取出兩側(cè)輸卵管和卵巢置于盛有M2培養(yǎng)液液滴的培養(yǎng)皿中，在雙筒體視顯微鏡下，用顯微鑷撕開輸卵管膨大的壺腹部，釋出卵母細(xì)胞－卵丘細(xì)胞復(fù)合體。將卵母細(xì)胞－卵丘細(xì)胞復(fù)合體收集到含有0.1%透明質(zhì)酸酶的 M2液滴中，處理3～5 min，移入M2液滴中，洗滌1～2次，在體視顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察，計(jì)算卵母細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)于不同周齡以及不同激素劑量各組間的比較采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同周齡的長爪沙鼠超數(shù)排卵的效果

在本試驗(yàn)中，我們對(duì) 4、6、8、10、12、14、16、18 周齡的長爪沙鼠分別腹腔注射10 IU的PMSG/HCG后對(duì)其超數(shù)排卵的卵母細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，與其他各年齡組相比，6周齡組的動(dòng)物取卵總數(shù)最高，而且動(dòng)物個(gè)體間的超排數(shù)量差異較小，超排效果比較穩(wěn)定。6周齡后隨著年齡的增加，取卵數(shù)呈下降趨勢。

2.2 不同激素劑量水平對(duì)長爪沙鼠超數(shù)排卵后的效果

鑒于目前對(duì)長爪沙鼠超數(shù)排卵的激素劑量水平還不十分清楚，我們分別用 5、10和 15 IU的PMSG/HCG 3個(gè)劑量對(duì)其進(jìn)行了超數(shù)排卵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 IU組的超數(shù)排卵后卵卵母細(xì)胞總數(shù)最高，5 IU的最低，15 IU劑量組的介于二者之間，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)劑量組之間差異有顯著性(P＜0.05)(表1)。

圖1 不同周齡動(dòng)物超排后的取卵數(shù)平均值Fig.1 The average number of eggs obtained in gerbils ofdifferent weeks－ages after superovulation

表1 經(jīng)3個(gè)不同劑量腹腔注射PMSG/HCG于6周齡的長爪沙鼠后超數(shù)排卵的結(jié)果Tab.1 Results of superovulation after intraperitoneal injection of 5，10，15 IU PMSG/HCG in gerbils at the age of 6 weeks

3 討論

對(duì)小型嚙齒類動(dòng)物而言，選擇適當(dāng)年齡段的動(dòng)物超數(shù)排卵是非常重要的。年齡太小，發(fā)育不成熟，無法完成排卵過程;年齡太大，激素對(duì)其發(fā)育過程的干預(yù)有限，也無法得到數(shù)量較多的卵母細(xì)胞。因此，有許多文獻(xiàn)對(duì)小鼠、金黃地鼠、布氏田鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的超數(shù)排卵年齡進(jìn)行了研究［7－9］。對(duì)長爪沙鼠而言，關(guān)于其超數(shù)排卵的文獻(xiàn)只有 Mochida KJ等［10］的報(bào)道，他們選用8～18周齡的動(dòng)物進(jìn)行了超數(shù)排卵和胚胎冷凍的研究。分析本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，參照封閉群小鼠的經(jīng)驗(yàn)［7］，我們用4周齡剛離乳的沙鼠進(jìn)行超數(shù)排卵，結(jié)果取卵數(shù)為0，4只動(dòng)物均沒有收集到卵母細(xì)胞，且觀察到其卵巢較小，可能該年齡的動(dòng)物還不具備產(chǎn)生卵子的能力。而隨著年齡的增加，超排數(shù)量減少，可見激素對(duì)其排卵的干預(yù)能力受限，如果要取得較好的超排效果，應(yīng)該結(jié)合陰道涂片的結(jié)果和考慮其發(fā)情周期來確定超排注射激素的時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Mochida KJ等的略有差異，其一可能是所用動(dòng)物種群不同造成的差異，其二基于胚胎冷凍的目的，其文中并未詳細(xì)說明不同動(dòng)物周齡收集胚胎數(shù)量的差異，但這種差異應(yīng)該是存在的。

超數(shù)排卵的劑量選擇一直是該實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，有多個(gè)報(bào)道對(duì)小鼠、家兔、金黃地鼠、布氏田鼠、豬等等動(dòng)物實(shí)施超數(shù)排卵的激素劑量進(jìn)行了研究［8，9，11－13］。本文僅僅設(shè)定了 5、10 和 15 IU 3 個(gè)劑量組對(duì)長爪沙鼠進(jìn)行了超排實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 IU組和15 IU組收集的卵母細(xì)胞數(shù)量有一定的差別，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，在實(shí)際工作中可以考慮采用10 IU PMSG/HCG對(duì)長爪沙鼠進(jìn)行超數(shù)排卵。

［1］Arguello GarciaR，OrtegaPierres MG. Giardia duodenalis:Analysis of humoral immune response in experimentally infected gerbils(Meriones unguiculatus)［J］.Arch Med Res，1997，28:171－178.

［2］Cruz YR，Tamos YM，Cernuda AM，et al.Treatment with nasal neuro－EPO improves the neurological，cognitive，and histological state in a gerbil model of focal ischemia［J］.Sci World J，2010，10:2288－2300.

［3］Segatelli TM，F(xiàn)ranca LR，Pinheiro PF，et al.Spermatogenic cycle length and spermatogenic efficiency in the gerbil(Meriones unguiculatus)［J］.J Androl，2004，25(6):872－880.

［4］Lee CH，Yoo KY，Choi JH，et al.Cyclin D1 immunoreactivity changes in CA1 pyramidal neurons and dentate granule cells in the gerbil hippocampus after transient forebrain ischemia［J］.Neurol Res，2011，33(1):93－100.

［5］Gleich O，Weiss M，Strutz J.Age－dependent changes in the lateral superior olive of the gerbil(Meriones unguiculatus)［J］.Hear Res，2004，194(1－2):47－59.

［6］Matsubara S，Shibata H，Takahashi M，et al.Cloning of Mongolian gerbil cDNAs encoding inflammatory proteins，and their expression in glandular stomach during H.pylori infection［J］.Cancer Sci，2004，95(10):798－802.

［7］薛亮亮，雷小春，司蘇晉，等.近交系C57小鼠與封閉群昆明小鼠超排卵數(shù)的比較［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(3):225－226.

［8］包華瓊 孫嵐，任彬林，等.金黃地鼠超數(shù)排卵模型的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(7):52－54.

［9］潘思丹，施海霞，宋銘晶.SPF級(jí)布氏田鼠的繁殖及生長發(fā)育性能測定［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21(1):92－94.

［10］Mochida KJ，Wakayama T，Takano K，et al.Birth of offspring after transfer of Mongolian gerbil(Meriones Unguiculatus)embryos cryopreserved by vitrification［J］.Molec Reprod Dev，2005，70:464－470.

［11］王田娟，章志國，邢瓊，等.不同超排方法對(duì)家兔超數(shù)排卵效果的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(4):355－357.

［12］郭慶勇，況玲，蔣國英，等.激素的不同劑量對(duì)小鼠超數(shù)排卵的影響［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47(7):1466－1469.

［13］鄧凱偉，王峰，王志剛，等.豬超數(shù)排卵影響因素的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)(科技版)，2011，4:39－41.

Effect of Week-Age and Hormonal Level on Superovulation in Mongolian Gerbils

LU Jing1，ZHU Xiang－yu2，WANG Chao1，WANG Ying1，CHEN Zhen－wen1，DU Xiao－yan1
(1.Department of Laboratory Animals，Capital Medical University，Beijing 100069，China;2.Department of Laboratory Animals，Peking University Health Science Center，Beijing 100191)

Objective To investigate the influence of different week－age and the hormonal level on superovulation in Mongolian gerbils.Methods Eight groups of Mongolian gerbils at different age of 4－18 weeks were induced to superovulate by intraperitoneal injection of 10 IU PMSG/HCG，respectively.At 16－17 h after the last injection，the amounts of eggs of animals in different groups were counted and analyzed to determine the best week－age of superovulation.Superovulation was induced in the animals of best week－age by intraperitoneal injection of 5，10，15 IU PMSG/HCG to analyze the different amounts of eggs.Results Compared with other groups，the amount of eggs obtained in gerbils at age of 6 weeks is highest and there were significant differences among all groups(P＜0.05).The amounts of eggs obtained in groups of different PMSG/HCG doses were significantly different and that of the 10 IU group was highest.Conclusion

The age of 6 weeks and the dose of 10 IU PMSG/HCG are the best ages and effective dose to induce superovulation in Mongolian gerbils.

Mongolian gerbil;Week age;Pregnant mare＇s serum gonadotrophin，PMSG;Human chorionic gonadotropin，HCG;Doses;Superovuliation.

R33

A

1671－7856(2012)08－0015－03

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.003

2012－05－10

國家自然基金面上項(xiàng)目(No.31071988)和國家“十二五”科技支撐項(xiàng)目(No.2011BAI15B01)。

路靜，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)工作。

杜小燕，E－mail:duduyan@ccmu.edu.cn。