王 英，劉石磊，劉振偉，劉云海，倪和民，鄧桂馨，郭 勇

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

ICR胎鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化

王 英，劉石磊，劉振偉，劉云海，倪和民，鄧桂馨，郭 勇

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

目的 確定胎鼠成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)最優(yōu)制備方法，為MEF的制備節(jié)省時間與原材料。方法 取胎鼠組織，采用組織塊培養(yǎng)法、胰酶消化培養(yǎng)法、胰酶消后組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行分離培養(yǎng)MEF，比較觀察MEF純度、生長速度、細(xì)胞形態(tài)等指標(biāo)，篩選最節(jié)省時間與原料的一種培養(yǎng)方法。結(jié)果 組織塊培養(yǎng)法所得MEF生長速度慢，細(xì)胞體積小，雜細(xì)胞少，純化所需傳代次數(shù)少。胰酶消化培養(yǎng)法的MEF生長速度快，體積較大，雜細(xì)胞數(shù)量多，純化所需傳代次數(shù)較多。胰酶消化后組織塊培養(yǎng)法的消化后組織塊的成纖維細(xì)胞生長速度介于前兩種方法之間，細(xì)胞體積和形態(tài)與組織塊法培養(yǎng)結(jié)果相似，雜細(xì)胞數(shù)量較少，純化所需傳代次數(shù)少。結(jié)論 胰酶消化結(jié)合組織塊培養(yǎng)法能最大限度的利用材料，在短時間內(nèi)可制備大量MEF，滿足核移植試驗與作為飼養(yǎng)層細(xì)胞的需求。因此，胰酶消化結(jié)合組織塊培養(yǎng)法是MEF最優(yōu)培養(yǎng)方法。

ICR小鼠;胚胎成纖維細(xì)胞;培養(yǎng)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)是來源于早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和原始生殖細(xì)胞的具有發(fā)育全能性的一類細(xì)胞［1－4］。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent cells，iPSC)是成熟的體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后又轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂腥苄缘募?xì)胞［5－8］。ESC、iPSC體外增殖培養(yǎng)過程中首要解決的問題是抑制它們的分化。雖然在培養(yǎng)基中添加一些分化抑制因子能起到一定作用，但是效果不是很理想。成纖維細(xì)胞能夠分泌成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，a-FGF，b-FGF)等生長因子和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等細(xì)胞分化抑制因子，具有能夠改善接種細(xì)胞生長環(huán)境、促進(jìn)接種細(xì)胞增殖同時抑制細(xì)胞分化的作用，已經(jīng)成為培養(yǎng)ESC、iPSC的主要飼養(yǎng)層細(xì)胞。另外，自1996年多利羊誕生以來，體細(xì)胞克隆已經(jīng)成為了科學(xué)界保護(hù)瀕危物種、保存優(yōu)良種畜、產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物等的主要方法［9］。而成纖維細(xì)胞借助取材方便、易于鋪層、容易生長等優(yōu)勢成為體細(xì)胞克隆的首選供體細(xì)胞。常規(guī)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)主要采用組織塊法與胰酶消化法。前者成纖維細(xì)胞原代生長所需時間較長;而后者生長出的原代細(xì)胞中雜細(xì)胞較多，需多次傳代才能得到純化的成纖維細(xì)胞。兩種培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的常規(guī)方法均不能滿足短期內(nèi)對飼養(yǎng)層細(xì)胞的大量需求;為此本實驗通過比較三種不同MEF的培養(yǎng)方法，從而確定一種MEF最優(yōu)培養(yǎng)方法，進(jìn)而能更快更好地為小鼠干細(xì)胞制備與核移植實驗提供大量的飼養(yǎng)層細(xì)胞與供體細(xì)胞。

1 實驗動物與試劑

1.1 動物

6～8周齡ICR小鼠購自維通利華公司(生產(chǎn)許可證號碼:SCXK－(京)2006－009)，自然光照環(huán)境培養(yǎng)。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Sigma公司)，0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(Sigma公司)，DPBS(Sigma公司)，二甲基亞砜(Sigma公司)。DMEM培養(yǎng)液1 L:13.4 g DMEM粉末，3.7 g NaHCO3，0.063 g 青霉素，0.10 g 鏈霉素，10% 胎牛血清。

2 實驗方法

2.1 ICR小鼠胚胎的獲得

將正常發(fā)情6～8周齡雌鼠與公鼠2∶1合籠，次日上午9∶00檢查陰栓，陽性雌鼠單獨飼養(yǎng)，并記為妊娠0.5 d。

2.2 MEF原代培養(yǎng)

在13.5 d時，將懷孕母鼠脫頸處死，用酒精擦拭腹部皮膚，無菌開腹，剪下子宮。于超凈臺中，用DPBS將子宮血洗凈后剪開子宮、胎膜，釋放出胎鼠，用 DPBS將胎鼠洗凈，去除胎鼠頭尾、四肢、內(nèi)臟，將剩余部分組織用 DPBS洗凈后剪成肉泥狀。將組織分為兩份。

2.2.1 組織塊培養(yǎng)法:用胎牛血清潤濕60mm培養(yǎng)皿，將一份組織均勻分散在培養(yǎng)皿中(每個培養(yǎng)皿約接種一只胎鼠組織)。吸凈培養(yǎng)皿中多余血清后將接種組織的培養(yǎng)皿倒置放入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中約3 h。取出培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿加DMEM培養(yǎng)液3mL后，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2.2 胰酶消化法培養(yǎng)法:將剩余組織放入10mL玻璃離心管中，加入胰酶溶液，液面沒過組織塊，用吸管吹打混勻組織塊。將離心管放入培養(yǎng)箱靜置5 min，取出加入同胰酶等體積的DMEM培養(yǎng)液，用吸管混勻以終止消化，在培養(yǎng)箱繼續(xù)靜置5 min后，將上清轉(zhuǎn)入另一干凈的10mL玻璃離心管中。按照上述方法將組織消化3次，收集上清液。

將裝有上清的離心管以1 000 r/min離心10 min或1 500 r/min離心5 min，棄上清液。用DMEM培養(yǎng)液懸浮沉淀細(xì)胞后，將細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中(每個培養(yǎng)皿約接種一只胎鼠消化下的細(xì)胞)，每個培養(yǎng)皿補培養(yǎng)液至 2mL，后放入 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2.3 胰酶消化后組織塊培養(yǎng)法:將胰酶消化后剩余的組織塊用同2.2.1的方法移入培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 MEF傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底80%～90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液吸凈，用DPBS洗3遍，每個培養(yǎng)皿用250 μL胰酶消化約1～1.5 min，鏡下觀察細(xì)胞大部分變圓但沒有脫離培養(yǎng)皿底時，加1mL DMEM培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞從皿底吹起(對于較大的組織塊，待同細(xì)胞一塊消化下后將其用鑷子除去)，然后按1∶2或1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，接種密度為1.5×105個/mL。之后每2～3 d傳代1次。

2.4 MEF凍存與復(fù)蘇

細(xì)胞純化后，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底80%～90%時，進(jìn)行細(xì)胞凍存。根據(jù)傳代方法進(jìn)行消化，然后將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液移入10mL離心管中，1 000 r/min離心10 min或1 500 r/min離心5 min，離心完后棄上清液。用單純的DMEM液重懸細(xì)胞，移入凍存管中，然后逐滴加入4℃預(yù)冷DMSO:FBS混合液(細(xì)胞凍存密度約為 1×106個/mL，DMSO∶FBS∶單純DMEM液 =1∶2∶7)。按以下程序凍存:4℃ (30～40)min，－20℃ (1.5～2)h，－80℃ 過夜，最后液氮中長期保存。復(fù)蘇時，從液氮中取出凍存的細(xì)胞迅速放入37℃水浴中，不斷搖晃凍存管使凍存液1～2 min之內(nèi)融化，75%酒精消毒管外壁。離心去上清，用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，移入60mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

3 實驗結(jié)果

3.1 組織塊培養(yǎng)法

細(xì)胞生長速度最慢，20 d左右才有細(xì)胞從組織塊周圍爬出，約1個月才可傳代;長出的雜細(xì)胞最少，細(xì)胞體積較小，細(xì)胞形態(tài)幾乎均為典型的梭形，細(xì)胞彼此連接成片，整體上觀察如水流狀或放射狀(如圖1)。傳代2～3次可得到純化的成纖維細(xì)胞。

3.2 胰酶消化法培養(yǎng)法

細(xì)胞在2～3 h內(nèi)即可貼壁生長，繁殖速度最快，如果細(xì)胞密度合適，2～3 d即可傳代1次;雜細(xì)胞數(shù)量最多;貼壁細(xì)胞密度小時，細(xì)胞體積較大，多為柵欄狀、有較大觸角等;細(xì)胞密度適宜時，細(xì)胞呈梭形;如果細(xì)胞密度過大，細(xì)胞則呈鵝卵石狀(如圖2)。傳代3～4次可得到純化的成纖維細(xì)胞。

3.3 胰酶消化后組織塊培養(yǎng)法

次日即有細(xì)胞從組織塊爬出生長，15 d左右即可傳代;雜細(xì)胞種類較少;細(xì)胞體積同單純的組織塊培養(yǎng)方法得到的細(xì)胞體積相似;細(xì)胞形態(tài)也多為典型的梭形，細(xì)胞連接成片，整體上看如水流狀或放射狀(如圖3)。傳代2～3次即可獲得純化的成纖維細(xì)胞(圖1～3見封底)。

4 討論

ICR小鼠是國際通用的價格比較低廉的一種封閉群小鼠，因其遺傳性能穩(wěn)定、適應(yīng)性強、繁殖能力強、實驗重復(fù)性好，目前被廣泛選為實驗用鼠。前人實驗證明，12.5 d～14.5 d［10－12］胎齡的小鼠適于制備MEF;但是12.5 d小鼠胚胎個體較小，不利于徹底去除頭、尾、四肢、內(nèi)臟;14.5 d小鼠個體較大，骨骼肌開始發(fā)育，不利于組織的剪碎與細(xì)胞培養(yǎng);13.5 d小鼠胚胎從胚胎體積、各組織發(fā)育程度等方面考慮都最適宜用于MEF培養(yǎng)。本實驗通過比較3種不同培養(yǎng)方法培養(yǎng)MEF，觀察比較MEF的生長速度、細(xì)胞形態(tài)、純化所需時間等來確定一種最快、最優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)MEF細(xì)胞的方法，為 ESC、iPSC與核移植試驗提供足夠的符合要求的飼養(yǎng)層細(xì)胞與供體細(xì)胞。

組織塊培養(yǎng)法只是用物理方法將皮膚制成組織塊，影響細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)不能被去除，因此，細(xì)胞的生長速度比較慢，接種20 d后，組織塊周圍才有細(xì)胞長出。同時，由于細(xì)胞間質(zhì)對細(xì)胞生長的妨礙，大部分雜細(xì)胞會因為營養(yǎng)物質(zhì)不充足和代謝產(chǎn)物不能及時排除而死亡，而成纖維細(xì)胞比較容易生長，不易受這些因素的影響，因此，組織塊法培養(yǎng)出的MEF雜細(xì)胞較少，傳代2～3次即可得到純化的MEF。

胰酶消化法是利用胰蛋白酶去除妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)如基質(zhì)、纖維等，使細(xì)胞不聚集在一起，從而形成懸液，利于細(xì)胞從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝產(chǎn)物。接種后細(xì)胞在幾小時內(nèi)即可貼壁生長，由于胰蛋白酶的消化作用，使各類細(xì)胞都能更好地生長，所以雜細(xì)胞數(shù)量較多，傳代3～4次可將雜細(xì)胞去除。

胰酶消化后組織塊培養(yǎng)法是將消化后剩余的組織塊按組織塊培養(yǎng)法的操作培養(yǎng) MEF。接種后24 h即有細(xì)胞從組織塊爬出生長，15 d即可傳代;雜細(xì)胞種類較少，傳代2～3次可得到純化的MEF。

鑒于上述培養(yǎng)結(jié)果，胰酶消化法結(jié)合消化后組織培養(yǎng)方法能在最短的時間內(nèi)獲得最大量純化的MEF，并且能夠充分利用實驗材料，減少浪費、縮短培養(yǎng)周期。

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Optimization of the Culture Method of ICR Mouse Embryonic Fibroblasts

WANG Ying，LIU Shi-lei，LIU Zhen，LIU Yun-hai，NI He-min，DENG Gui-xin，GUO Yong
(College of Animal Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China)

Objective To investigate a most suitable method for harvesting mouse embryonic fibroblasts(MEF)).Methods Three different protocols including tissue only，cell-trypsin digestion，and tissue-trypsin digestion were applied for harvesting and culturing MEF.The MEF growth speed and cell morphology were also compared and analyzed respectively among the 3 methods.Results The cell proliferation was slow，cell size was small，but cells of other types were very few in the tissue only method，but the duration of purification was short.In the cell-trypsin digestion method，the cell proliferation was fast，cell size was somewhat large，but there were a little bit more cells of other types and the duration of purification was somehow longer.Finally，in the tissue-trypsin digestion method，the cell proliferation was very slow，cell size was very small，but there were also very few cells of other types.The duration of purification was very short.Conclusions Our findings indicate that the most efficient method for collecting and culturing mouse embryonic fibroblasts is the protocol of tissue-trypsin digestion.

ICR mouse;Embryonic fibroblast;Culture

R33

A

1671-7856(2012)08-0048-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.011

2012-05-07

圖1 組織塊培養(yǎng)法
Fig.1 Fibroblasts obtained by tissue piece culture method

圖2 胰酶消化法培養(yǎng)
Fig.2 Fibroblasts obtained by trypsin digestion method

圖3 胰酶消化后組織塊培養(yǎng)
Fig.3 Fibroblasts obtained by trypsin digestion-tissue piece culture method

國家自然基金面上資助項目(31072185，30871836)，家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2011，飼料營養(yǎng)功能)。

王英(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:動物產(chǎn)科及胚胎工程。E-mail:izbmyqdh@163.com。

郭勇(1963－)，男，教授，研究方向:畜禽生殖生理與動物生物技術(shù)。E-mail:y63guo@126.com.