馮碧敏，陳麗娟，葉 云

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646000)

柔紅霉素是治療急性白血病的基本用藥，是一種強(qiáng)效蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，最嚴(yán)重的毒副反應(yīng)是心臟毒性和骨髓抑制。因其對患者的心臟功能有嚴(yán)重影響，甚至對患者的生命構(gòu)成威脅，限制了其臨床應(yīng)用。研究顯示，其所致心臟毒性存在明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。為此，筆者建立了測定血清中柔紅霉素濃度的高效液相色譜法，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Diones Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司);Kromasystem 2000型工作站(Bio.Tek Instrument Snl公司);AE 240型電子天平(瑞士Mettler公司);AS10200型超聲波清洗器(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)。注射用鹽酸柔紅霉素(Pharmacia公司，批號為8F1005－A，規(guī)格為20 mg/支);柔紅霉素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為130559－200501，含量為91%);多柔比星對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為130509－200301，含量為97.4%);甲醇(批號為 10071753)，乙腈(批號為 10071743)均來自Honeywell Burdick Jackson，公司;重蒸餾水。血樣，SD大鼠在試驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，全程不禁飲水;空白大鼠血清自空白大鼠股動脈處取血，樣品血清自大鼠斷尾處取血。將采集的全血靜置30 min后，離心(3000 r/min)15 min，分取血清，于低溫冰箱－20℃存放、待用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Phenomenex C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);紫外檢測波長:233 nm;流速:1.0 mL/min;流動相:甲醇 － 0.01 mol/L 磷酸二氫銨溶液(稀磷酸調(diào)節(jié) pH 至4.65)－冰醋酸(30∶20∶0.1)，過濾并脫氣;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20 μL;內(nèi)標(biāo):多柔比星。在此條件下，柔紅霉素、內(nèi)標(biāo)出峰時間分別為 9.67，6.03 min，且無雜峰干擾測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液配制

精密稱取柔紅霉素對照品4.06 mg(91.0%)，置 25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得147.78 mg/L的柔紅霉素對照品貯備液，于冰箱4℃存放，臨用前用精密稱取多柔比星對照品2.71 mg(97.0%)，置 25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得 105.2 μg/mL的多柔比星對照品貯備液，于冰箱4℃存放。

2.3 血清樣品測定方法

精密吸取血清樣品0.1 mL，置離心管中，再精密加入內(nèi)標(biāo)2.06 μg/mL 的多柔比星對照品溶液 0.1 mL，加入 0.1 mL 甲醇，混勻，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋5 min后，3 500 r/min 離心 10 min，取上清液于30℃水浴放置，空氣流吹干，殘留物以甲醇50 μL溶解，離心 5 min，取上清液，進(jìn)樣 20 μL。

2.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和定量限考察:于0.1 mL空白大鼠血清中，精密加入柔紅霉素對照品貯備液(147.78 mg/L)，制 成 0.147 8，0.369 5，0.738 9，1.477 8，3.694 5，7.389 0，14.778 0 mg/L 的對照品溶液。照2.3項下方法操作，以待測物與內(nèi)標(biāo)峰高的比值(Y)對質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=0.000 3X+0.060 7，相關(guān)系數(shù) r=0.998 4，柔紅霉素質(zhì)量濃度在 0.147 8～14.77 8 mg/L范圍內(nèi)與峰高比值線性關(guān)系良好。最低定量限為0.100 mg/L(S/N=3)。

精密度試驗(yàn):于空白大鼠血清0.1 mL中，分別加入上述低、中、高(0.738 9，3.694 5，14.778 mg/L)質(zhì)量濃度的柔紅霉素對照品溶液各0.1 mL，漩渦混合5 min，照2.3項下方法測定。每種質(zhì)量濃度樣品平行配制5份，在1日內(nèi)不同時間點(diǎn)測定，考察日內(nèi)精密度;在1周內(nèi)分別平行制備上述樣品5份并測定，考察日間精密度。結(jié)果見表1。

加樣回收試驗(yàn):于0.1 mL空白大鼠血清中，分別加入上述低、中、高 3 種質(zhì)量濃度(0.738 9，3.694 5，14.778 mg/L)的柔紅霉素對照品溶液各0.1 mL，漩渦混合 5 min，照 2.3項下方法操作，取20 μL進(jìn)樣測定(n=5)，記錄兩者峰高與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰高的比值并代入回歸方程，計算出柔紅霉素的濃度，測得量與真實(shí)值的比值即為相對回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s，n=5)

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s，n=5)

加入量(μg/L)0.738 9 3.694 5 14.778 0測得量(μg/L)0.768 5 ± 0.030 3 3.631 7 ± 0.103 4 14.721 3 ± 0.339 9相對回收率(%)104.0 ± 4.1 98.3 ± 2.8 99.6 ± 2.3 X(%)102.5 98.7 99.3日內(nèi)RSD(%)3.85 4.50 2.60日間RSD(%)8.21 4.17 2.01

穩(wěn)定性試驗(yàn):取精密度試驗(yàn)項下制備的3個質(zhì)量濃度的樣品，分別考察在－20℃環(huán)境中避光儲存保存96 h和凍融3次的穩(wěn)定性，結(jié)果的 RSD分別為1.6% ～7.0%和1.2% ～6.5%。

2.5 血清藥物濃度測定

將SD大鼠在試驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，全程不禁飲水，稱取體重，分別于尾靜脈注射給藥柔紅霉素3 mg/kg，給藥后3，15，30，60，120，240，480 min時自尾靜脈斷尾取血，血清經(jīng)未加肝素鈉自然凝結(jié)離心后，分取血清檢測。結(jié)果血藥濃度為0.72～1.956 mg/L。

3 討論

文獻(xiàn)[1]報道柔紅霉素的檢測波長為233 nm，曾對210，233，254，290，296 nm波長分別進(jìn)行檢測，結(jié)果柔紅霉素在233 nm波長處有最大吸收，在提高藥物的最低檢測限的同時，血清中的干擾物質(zhì)吸收度也較小。

文獻(xiàn)[2]報道用乙腈－磷酸二氫鈉－三乙胺(34∶66∶0.3)作流動相。曾比較了乙腈－水系統(tǒng)和甲醇－磷酸緩沖溶液系統(tǒng)，結(jié)果乙腈－水系統(tǒng)不出峰，甲醇－0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液(pH=4.65)－冰醋酸(30∶20∶0.1)作流動相時柔紅霉素峰形良好、分離度高，且血清中內(nèi)源性雜質(zhì)對柔紅霉素色譜峰無干擾。

筆者曾用全血進(jìn)行測定，但抗凝劑肝素鈉會與藥物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物，影響血藥濃度測定，故選取不加任何成分的血清進(jìn)行測定。血清處理時應(yīng)注意，水浴溫度過高、離心轉(zhuǎn)速過大、時間過長，均會破壞紅細(xì)胞，造成測定結(jié)果不準(zhǔn)、重現(xiàn)性差。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的高效液相色譜法簡便、快速、靈敏，為進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 (一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:265－266.

[2]張 華，齊憲榮，張 強(qiáng)，等.柔紅霉素循環(huán)脂質(zhì)體的藥劑學(xué)性質(zhì)及大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2002，37(4):299－303.