王曉明 許林海 聶良明 孟群

干細(xì)胞移植作為一種新興的醫(yī)療技術(shù)，為治療心肌梗死和心力衰竭患者開辟了新的途徑［1］。細(xì)胞治療是將具有分化潛能的干細(xì)胞移植到心肌梗死區(qū)，使其分化成心肌樣細(xì)胞或促進(jìn)血管生成，從而達(dá)到改善心臟功能的目的。這些細(xì)胞主要來源包括胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞［1-2］。心源性干細(xì)胞主要存在于心外膜［3-4］，而心外膜組織和心包膜組織作為心包的臟、壁層并覆以脂肪組織，在心臟發(fā)育過程中共同起源于心臟流出道的第二心區(qū)細(xì)胞群。最近的研究表明，WT1是一個(gè)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與了胚胎期心臟發(fā)育和心肌受損后的修復(fù)。WT1陽(yáng)性細(xì)胞主要存在于心外膜前細(xì)胞群(即第二心區(qū)的起源細(xì)胞)，當(dāng)WT1蛋白表達(dá)后，可以通過激活細(xì)胞內(nèi)snail/β聯(lián)蛋白(catenin)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition)而進(jìn)一步獲得遷移和分化能力［5］。WT胚胎蛋白在心肌受損后可以重新激活，這可能是心肌自我修復(fù)過程的內(nèi)在機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)從心肌梗死大鼠心包膜組織中分離、培養(yǎng)WT1陽(yáng)性細(xì)胞，并分析其細(xì)胞特性及分化成心肌細(xì)胞的能力，為探索心包膜組織干細(xì)胞作為治療缺血性心臟病的供體細(xì)胞來源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar雄性大鼠10只(清潔級(jí))，鼠齡4～6周，體質(zhì)量200～300 g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬2008-0016)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、Ⅰ型膠原酶、谷氨酰胺、FBS、胰島素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;吲哚鎂辛、地塞米松、5-氮雜胞苷、維生素C、3-甘油磷酸鈉、中性甲醛購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;培養(yǎng)瓶和所有其他培養(yǎng)耗材均為丹麥NUNC產(chǎn)品;Chamber Slide購(gòu)自德國(guó)Ibidi公司;WT1單克隆抗體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體KDR單克隆抗體、心臟肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)單克隆抗體、α-MHC多克隆抗體及c-kit單克隆抗體(sc-1949，sc-190)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;TRITC標(biāo)志的羊抗兔抗血清、FITC標(biāo)志的羊抗鼠抗血清和Isl-1抗體均購(gòu)自德國(guó)Dako公司;反轉(zhuǎn)錄PCR Mini試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。數(shù)碼成像用奧林巴斯BX61熒光顯微鏡和CellSen成像系統(tǒng)。

1.2 建立大鼠心肌梗死模型

大鼠心肌梗死模型建立參照以往方法［6］。大鼠在異氟烷誘導(dǎo)下行氣管插管并施吸入麻醉，呼吸機(jī)輔助呼吸。大鼠取右側(cè)臥位，消毒后在第三和第四肋間作一橫行切口，依次切開皮膚及深、淺筋膜。鈍性分離胸大肌、前鋸肌、肋間肌，牽開肋骨，暴露中上部心包，定位冠狀動(dòng)脈左前降支并以6-0 Prolene線縫扎。結(jié)扎后可見左前降支下方大面積心肌表面變蒼白，室壁運(yùn)動(dòng)明顯減弱，心電圖顯示ST段抬高。手術(shù)以后逐層縫合、關(guān)胸。大鼠呼吸平穩(wěn)后拔出氣管插管。術(shù)后大鼠置于電熱毯上保溫。

1.3 心包膜組織干細(xì)胞分離和培養(yǎng)

造模7 d后，二氧化碳窒息法處死大鼠，75%酒精浸泡3 min。無菌操作下剪開大鼠腹部，沿肋骨邊緣將膈膜小心剪開，露出胸腔。沿胸腺下緣完全分離心包組織，包括脂肪組織(90%)和很薄的心包膜。剪下后，先用PBS清洗1次，將組織充分剪碎，再用PBS洗去脂肪滴，加入3倍體積的膠原酶;吹勻后轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管中。37℃水浴中消化30 min(每隔5 min取出充分搖勻);100目濾網(wǎng)過濾。分離細(xì)胞經(jīng)Ficoll密度梯度離心，去除炎癥細(xì)胞和其他血細(xì)胞。獲得間充質(zhì)細(xì)胞組分后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液(低糖DMEM培養(yǎng)液，30%FBS，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，2 mmoL/L谷氨酰胺，pH 7.2)重懸細(xì)胞，接種到T25培養(yǎng)瓶中。第3天進(jìn)行觀察換液，棄未貼壁細(xì)胞。以后每3 d換液1次。細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA，0.04 mL/cm2)消化后傳代，傳代比例為1∶3，標(biāo)記為第1代(P1)，以后每3 d換液1次。細(xì)胞近單層融合時(shí)傳代，分別標(biāo)記為Pn(n=1，2，3……)，分別在第 5，8，11，15，25，50，70天測(cè)定細(xì)胞數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)，推算出總細(xì)胞數(shù)，繪出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)同時(shí)取一小塊心肌組織，用上述方法分離和培養(yǎng)心臟干細(xì)胞［3］，作為心包膜組織干細(xì)胞培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)對(duì)照。

1.4 心包膜組織干細(xì)胞自我更新能力測(cè)定

取原代細(xì)胞，通過體外連續(xù)傳代(方法同1.3)，分析觀察傳代細(xì)胞形成心球樣細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目，以此測(cè)定細(xì)胞自我更新能力。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心包膜組織干細(xì)胞免疫表型

取P3細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%鋪滿時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化分離，離心后用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3.0×106/mL。根據(jù)需要，將100 μL細(xì)胞懸液分裝于2 mL離心管，并按量于各個(gè)樣品管內(nèi)加入相對(duì)應(yīng)的抗體，包括CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106(1 ∶100 ～1 ∶200 稀釋)。4℃避光孵育30 min后，于每樣品管內(nèi)添加2 mL PBS，離心后棄上清液，分離游離抗體。最后，每樣品管加入500 μL PBS，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心包膜組織干細(xì)胞免疫表型

將P1細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)玻片中，3 d后作免疫組織化學(xué)法染色。培養(yǎng)玻片先抽去培養(yǎng)液，用1%冷多聚甲醛固定后用羊血清封閉30 min，加入一抗(抗 WT1、KDR、GATA-4、Isl-1、cTnT、c-kit)置側(cè)擺搖床室溫下孵育2 h，然后用PBS洗去一抗，洗滌3次后加入二抗并孵育1 h，最后作DAPI染色，洗滌后用熒光封固劑封片，熒光顯微鏡下數(shù)碼成像。

1.7 藥物誘導(dǎo)心包膜組織干細(xì)胞分化及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)分化的心肌細(xì)胞

將分離的P2細(xì)胞以4000/cm2的密度接種于涂有層粘連蛋白的培養(yǎng)皿。細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)液換成DMEM(含5%馬血清、0.1 mmoL的5-氮雜胞苷和0.1 μmoL地塞米松)，每3 d更換一次培養(yǎng)液。14 d后分別取細(xì)胞做免疫組織化學(xué)法檢測(cè)和反轉(zhuǎn)錄PCR分析。藥物誘導(dǎo)后，心肌細(xì)胞的免疫組織化學(xué)法檢測(cè)一抗為cTnT和α輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)，方法同1.6。

1.8 提取誘導(dǎo)分化后細(xì)胞總RNA并作反轉(zhuǎn)錄PCR分析

誘導(dǎo)分化后細(xì)胞總RNA提取方法按照QIAGEN公司提供的Mini試劑盒操作。提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA后PCR擴(kuò)增，共40循環(huán)，產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯影。所用引物分別為:GATA4，5'-CTG TCA TCT CAC TAT GGG CA-3'和5'-CCA AGT CCG AGC AGG AAT TT-3';MEF-2c，5'-AGC AAG AAT ACG ATG CCA TC-3'和5'-GAA GGG GTG GTG GTA CGG TC-3';cTnT，5'-GCA AAG GAG GCT GAA GAT G-3'和5'-TTC CTC CTG TTC TCC TCC T-3';18S，5'-GTG GAG CGA TTT GTC TGG TT-3'和 5'-CGC TGA GCC AGT CAG TGT AG-3'。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞連續(xù)傳代形成心球樣細(xì)胞團(tuán)數(shù)量采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心包膜組織干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和生長(zhǎng)狀態(tài)

心肌梗死模型大鼠存活率約80%，有8只用于實(shí)驗(yàn)。原代細(xì)胞在接種24 h后貼壁;體外培養(yǎng)的心包膜組織干細(xì)胞成梭狀，培養(yǎng)3 d后呈60%鋪滿(見圖1A)。細(xì)胞復(fù)制時(shí)間約2.5 d。沒有觀測(cè)到脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化。當(dāng)P3細(xì)胞培養(yǎng)1周后，可見部分區(qū)域細(xì)胞聚集，光鏡下可見透亮細(xì)胞群，并慢慢成球狀細(xì)胞團(tuán)(見圖1B)，其形態(tài)與從心肌組織中分離的心臟干細(xì)胞形成的“心臟球”相似(見圖1C)。

圖1 心包膜組織干細(xì)胞培養(yǎng)后形態(tài)

4次細(xì)胞分離后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示:培養(yǎng)第10代以后，細(xì)胞仍然呈良好增長(zhǎng)(n=4)，見圖2。

2.2 心包膜組織干細(xì)胞的自我更新能力

體外培養(yǎng)的心包膜組織干細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，部分細(xì)胞聚集形成心球樣細(xì)胞團(tuán)(見圖3A、B)。傳代后，連續(xù)觀察P2至P5細(xì)胞形成心球樣細(xì)胞團(tuán)的能力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)數(shù)量沒有減少(見圖4，F(xiàn)=1.86，P＞0.05)，細(xì)胞仍然有心球樣結(jié)構(gòu)至P5，僅形態(tài)上較扁平(見圖3C)。

圖2 心包膜組織干細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

圖3 心包膜組織干細(xì)胞培養(yǎng)后克隆形態(tài)

2.3 心包膜組織干細(xì)胞免疫表型分析

流式細(xì)胞儀分析顯示，這些細(xì)胞呈 CD29、CD44、CD90陽(yáng)性，部分呈 CD106陽(yáng)性，而 CD34和CD45陰性(見圖5)。表明分離的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞特征，而沒有造血干細(xì)胞免疫表型。

免疫熒光染色顯示，經(jīng)Ficoll密度梯度離心獲得的心包膜組織干細(xì)胞約95%呈WT1陽(yáng)性染色，少量干細(xì)胞顯示cTnT陽(yáng)性染色，但cTnT染色為胞漿均勻分布，未見明顯的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)，表明心包膜干細(xì)胞中包含心肌前體細(xì)胞。同時(shí)，分離的干細(xì)胞為Isl-1陰性，少量的c-kit陽(yáng)性，部分細(xì)胞呈GATA-4、KDR陽(yáng)性(見圖6)。

圖4 心包膜組織干細(xì)胞培養(yǎng)傳代后細(xì)胞團(tuán)數(shù)比較

2.4 WT1陽(yáng)性細(xì)胞定向分化結(jié)果

5-氮雜胞苷和地塞米松誘導(dǎo)前細(xì)胞呈梭狀(見圖7A)。誘導(dǎo)7 d后，部分細(xì)胞體積增大，呈扁平狀貼壁，部分細(xì)胞聚集成細(xì)胞團(tuán)(見圖7B)。在細(xì)胞團(tuán)的邊緣區(qū)，可見單個(gè)細(xì)胞開始自發(fā)性博動(dòng)(見視頻1)。免疫組織化學(xué)法分析結(jié)果:80%細(xì)胞呈cTnT和α輔肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性，并可以觀測(cè)到明顯的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)(圖7C、D)。提示這些細(xì)胞為心肌細(xì)胞。

反轉(zhuǎn)錄PCR分析結(jié)果:誘導(dǎo)前WT1陽(yáng)性細(xì)胞有少量的GATA-4和cTnT表達(dá);誘導(dǎo)后一方面增強(qiáng)了心源性轉(zhuǎn)錄因子(GATA-4和MEF2c)的表達(dá)，另一方面也增強(qiáng)了心臟結(jié)構(gòu)蛋白(cTnT)在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，見圖8。提示W(wǎng)T1陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的心肌分化能力。

3 討論

胚胎干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問題很大程度上制約了細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用前景。雖然誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可以跨越這個(gè)障礙，但也存在諸如DNA不穩(wěn)定以及某些基因突變的遺傳學(xué)問題。在目前干細(xì)胞治療缺血性心臟病的研究中，更加注重可靠穩(wěn)定的成體干細(xì)胞作為細(xì)胞來源［1］，其中心源性干細(xì)胞由于其良好的組織相容性等優(yōu)點(diǎn)而越來越被重視［7-8］。我們的研究表明，心包膜組織富含各種具有間充質(zhì)干細(xì)胞特征的細(xì)胞群，這些細(xì)胞具有心臟干細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)特征，在藥物誘導(dǎo)下可以定向分化成心肌細(xì)胞。

圖5 心包膜組織干細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

圖6 心包膜組織干細(xì)胞免疫組織化學(xué)法分析結(jié)果

圖7 心包膜組織干細(xì)胞定向分化后免疫熒光觀察結(jié)果

脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育過程中，左、右心室和室間隔首先形成，稱為第一心區(qū)，而第二心區(qū)心臟組織則起源于流出道和心臟基底部細(xì)胞群，通過向心尖部遷移、分化形成心外膜和冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)［9］。心包膜組織與心外膜一起共同構(gòu)成臟層和壁層心包，包裹心肌表面。目前發(fā)現(xiàn)，在第二心區(qū)發(fā)育過程中，有大量的具有心血管細(xì)胞分化潛能的心血管祖細(xì)胞殘留在心外膜組織，并參與心臟的自我修復(fù)［10-11］。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，從心包膜組織分離的細(xì)胞可以形成與心臟干細(xì)胞相似的球狀形態(tài)［7］，這些分離細(xì)胞表面的免疫表型也與間充質(zhì)干細(xì)胞相似(CD29、CD44、CD90陽(yáng)性)，但不表達(dá)造血干細(xì)胞的免疫表型(CD34陰性)。從心包膜組織分離的細(xì)胞呈CD90陽(yáng)性，并在特定的誘導(dǎo)條件下可以分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化(將在另文報(bào)道)以及心肌細(xì)胞。由于獲得的脂肪干細(xì)胞不適合通過在體連續(xù)移植來證明其自我更新能力，我們利用這些細(xì)胞具有形成克隆樣結(jié)構(gòu)(心球樣細(xì)胞團(tuán))能力特征，在離體條件下通過體外連續(xù)傳代［12］，觀察到P5細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)和數(shù)目并無明顯變化，表明這些細(xì)胞具有自我更新能力。因此，我們認(rèn)為本研究獲得的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征和分化中胚層細(xì)胞的潛能。

圖8 心包膜組織干細(xì)胞定向分化后反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果

研究表明，心外膜心臟干細(xì)胞免疫表型分別有Isl-1［13］、flk-1/KDR［14-15］、sca-l［16］以 及 c-kit［17-18］。在心臟組織中，比較公認(rèn)c-kit為心臟干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白［19］。本研究結(jié)果:從心包膜組織分離的干細(xì)胞Isl-1呈陰性，只有很少量的c-kit陽(yáng)性細(xì)胞，部分細(xì)胞呈KDR和GATA-4陽(yáng)性，然而WT1陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到95%。

目前還沒有一種非常特異的細(xì)胞標(biāo)志可以確定心臟干細(xì)胞［20］。近期有2篇文獻(xiàn)分別報(bào)道心外膜心臟祖細(xì)胞可表達(dá)WT1，這些WT1陽(yáng)性細(xì)胞在急性心肌梗死小鼠的心肌修復(fù)中發(fā)揮了重要作用［21-22］。WT1最早發(fā)現(xiàn)與腎腫瘤發(fā)病有關(guān)［23］。WT1基因位于11號(hào)染色體第13位點(diǎn)，編碼蛋白C-端含4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)以及N-端富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA結(jié)合域，是一個(gè)非常重要的胚胎期轉(zhuǎn)錄因子［24］，參與了胚胎期心臟發(fā)育［21，25］。利用基因敲除的方法阻斷WT1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)心臟發(fā)育不完整，且小鼠均死于胚胎期第16～18天［8］。在心臟發(fā)育過程中，WT1介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程在第二心區(qū)和冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)形成過程中起關(guān)鍵作用［26］，且當(dāng)心肌損傷后WT1可以重新被激活［21-22］。基于此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用密度梯度離心法獲得相對(duì)純化的WT1陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果這些細(xì)胞生長(zhǎng)良好，并在藥物誘導(dǎo)條件下，可以定向分化成心肌細(xì)胞，表明心包膜組織來源的WT1陽(yáng)性細(xì)胞具有心肌細(xì)胞分化的潛能。

總之，本實(shí)驗(yàn)從大鼠心包膜組織分離到WT1陽(yáng)性心臟干細(xì)胞，這些心臟干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特征，能夠分化成心肌細(xì)胞。由于心包膜組織具有取材方便的特點(diǎn)，可以此作為心臟疾病細(xì)胞治療中非常有意義的干細(xì)胞來源。

志謝 感謝德國(guó)杜塞爾多夫大學(xué)分子心臟研究所丁兆平博士在本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫過程中給予的大力幫助

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