安楠 張漓 徐建方 路瑛麗 趙鵬 趙杰修 何子紅 馮連世

國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）

運動對成長期大鼠骨骼肌神經(jīng)肌肉連接形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響

安楠 張漓 徐建方 路瑛麗 趙鵬 趙杰修 何子紅 馮連世

國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）

目的：探討神經(jīng)肌肉連接（Neuromuscular junction，NMJ）形態(tài)結(jié)構(gòu)在成長期（斷乳－性成熟）的發(fā)育特征及運動對這一過程的影響。方法：3周齡（斷乳）Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為對照組（C組）、運動組（T組）和懸吊組（H組），運動組和懸吊組分別進(jìn)行運動增強(qiáng)（跑臺運動）和運動減弱（尾部懸吊）干預(yù)至8周齡（性成熟），分別于4周齡、5周齡、6周齡、8周齡進(jìn)行腓腸肌運動終板熒光及組織化學(xué)染色和圖像測量，比較各組間運動終板形態(tài)、數(shù)量、面積、周長和膽堿酯酶（AchE）含量的差異。結(jié)果：運動終板形態(tài)受周齡和運動干預(yù)雙重影響，對照組4周齡終板面積和終板周長顯著高于3周齡（P<0.01），對照組6周齡終板面積和終板周長顯著高于5周齡（P<0.01）；對照組4周齡運動終板計數(shù)顯著低于3周齡（P<0.01）；懸吊組4周齡和5周齡終板計數(shù)顯著低于同齡對照組（P<0.05）。腓腸肌AchE含量僅受周齡影響，對照組4周齡AchE染色OD值顯著高于3周齡（P<0.01）。結(jié)論：大鼠成長期NMJ形態(tài)在出生后早期（4周齡以前）及青春期均明顯發(fā)育；其重要的結(jié)構(gòu)成分AchE含量在出生后早期顯著升高，之后保持穩(wěn)定；運動可以在一定程度上促進(jìn)成長期NMJ形態(tài)的發(fā)育，具有階段性顯著增長的特征，但不影響AchE含量的穩(wěn)定。

神經(jīng)肌肉接頭；成長期；發(fā)育；形態(tài)；結(jié)構(gòu)

神經(jīng)肌肉連接（Neuromuscular Junction，NMJ）是神經(jīng)肌肉間進(jìn)行信號傳遞、實現(xiàn)運動功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。運動終板（motor end plate）即神經(jīng)肌肉連接位于肌纖維上的部分。出生后NMJ要完成從多神經(jīng)支配向單神經(jīng)支配的轉(zhuǎn)化過程，最終結(jié)果是每個肌細(xì)胞獲得一對一的高效率神經(jīng)支配，這一變化也是突觸消除的結(jié)果，得以保留的運動終板逐漸呈現(xiàn)出皺褶和分支狀態(tài)。目前認(rèn)為，這種變化是不同神經(jīng)元之間競爭的結(jié)果，受多種因素的調(diào)控［1］。研究表明，NMJ在哺乳動物出生后的一段時間內(nèi)表現(xiàn)為快速發(fā)育，出生后最初幾周，運動終板生長很快，其形態(tài)變化與肌纖維直徑增加呈正相關(guān)，結(jié)構(gòu)也有顯著變化［2］，以后逐漸減慢，至成年時形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能基本穩(wěn)定。近十幾年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肌肉活動可以對NMJ的形成、發(fā)育和功能進(jìn)行調(diào)控，其中多數(shù)研究支持運動干預(yù)可以促進(jìn)NMJ發(fā)育［3-5］的結(jié)論。如Desaulniers等提出，耐力訓(xùn)練使不同肌肉運動終板N乙酰膽堿受體（nAchR）數(shù)目增加，從而使形態(tài)發(fā)生變化［6］；Deschenes等發(fā)現(xiàn)，運動負(fù)荷對NMJ發(fā)育的促進(jìn)作用有一定的量效關(guān)系［7］，但機(jī)制尚不十分清楚；一些由神經(jīng)和肌肉釋放的因子可能參與了這個過程［8］。也有一些研究持相反的意見，如Andonian等［9］對SD大鼠進(jìn)行30天跑臺訓(xùn)練（1 h/day，速度漸增至30 m/min），未發(fā)現(xiàn)運動終板周長有顯著改變；Lynch等［10］也提出，運動后nAchR和AchE含量均未見變化。雖然對NMJ的研究一直是神經(jīng)生物學(xué)的熱點，但目前大量研究只集中在NMJ的發(fā)育機(jī)制，特別是各種信號及轉(zhuǎn)導(dǎo)過程方面，對于運動調(diào)控NMJ發(fā)育的確切作用尚不清楚，特別對運動在發(fā)育敏感期的作用關(guān)注不夠。本研究從運動訓(xùn)練學(xué)和神經(jīng)發(fā)育科學(xué)相結(jié)合的角度，觀察正常發(fā)育及運動干預(yù)下大鼠NMJ形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，了解NMJ在成長期的發(fā)育規(guī)律，探討運動對NMJ發(fā)育的作用。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

出生18天的Sprague-Dawley雄性大鼠130只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-（軍）2007-004］，隨機(jī)分為對照組（Control Group，C組）50只、運動組（Training Group，T組）40只和懸吊組 （Hanging Group，H組）40只。大鼠飼養(yǎng)和取材均在國家體育總局體育科學(xué)研究所SPF級動物實驗中心 ［動物使用許可證號：SYXK-（京）2010-030］進(jìn)行。

C組常規(guī)飼養(yǎng)，3周齡時取材10只。T組進(jìn)行跑臺運動，運動負(fù)荷從8 m/min、20 min/d開始，運動強(qiáng)度和運動時間交替增加，強(qiáng)度每次增加2 m/min，時間每次增加10min，至8周時達(dá)42 m/min、60 min/d。每天上午運動1次，每周運動6天，休息1天。H組采用尾部24小時連續(xù)懸吊造成后肢懸空去負(fù)荷，身體長軸與地面呈30°角，直至取材。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材

各組分別于4周齡、5周齡、6周齡、8周齡時取材，每組10只。按0.3ml/100g體重劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉，取腓腸肌，置于4%多聚甲醛＋30%蔗糖溶液中于4℃固定48 h后，用DD水清洗，置液氮中快速冰凍后，沿腓腸肌長軸作連續(xù)冰凍切片，片厚40μm，切片于室溫下風(fēng)干。每樣品選取靠近腓腸肌肌腹中、外三分之一處（此處NMJ含量豐富）切片10張，5張進(jìn)行熒光組織化學(xué)染色；5張進(jìn)行酶組織化學(xué)染色。

以下實驗操作均在首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所進(jìn)行。

1.2.2 主要儀器和試劑

Leica CM 3050S冰凍切片機(jī) （德國），Leica DM4000 B熒光顯微鏡 （德國），Leica Qwin圖像采集分析系統(tǒng)（德國），Acetylthiocholine iodide（碘化乙酰硫代膽堿）（Sigma，A5751），AgNO3（硝酸銀分析純）（北京中杉），α-Bungarotoxin-tetramethylrhodamine（羅丹明標(biāo)記的α-BTX）（Sigma，T0195）。

1.2.3 膽堿酯酶（AchE）―鍍銀染色

選切片入0.1mol/L醋酸緩沖液，浸泡30min。免疫組化筆標(biāo)記輪廓，滴加AchE染液，4℃過夜；染液配置 （10 mmol/L甘氨酸1 ml＋2 mmol/L硫酸銅1 ml＋50 mmol/L無水醋酸鈉1 ml＋0.1 mmol/L醋酸0.1 ml＋0.2 mmol/L異丙嗪1ml＋DD水6ml，染色前向溶液中加入碘化乙酰硫代膽堿11.6mg，終濃度為4mmol/L），所有切片一次染色完成。DD水漂洗5min×5次；切片入10%鐵氰化鉀顯色5～15 min，鏡下可見清晰的棕紅色即終止。DD水漂洗5min×2次；每樣品取5張切片，在Leica DMLA顯微鏡下每張切片觀察5個視野，可見清晰的棕紅色運動終板，40×物鏡下計數(shù)每個視野中完整肌束的運動終板，用Leica Qwin圖像采集分析系統(tǒng)采集圖像并測量AchE染色OD值。

已進(jìn)行AchE染色的切片放入DD水浸泡20min，濾紙吸干，滴加20%AgNO3，濕盒內(nèi)室溫避光染色1～2 h；濾紙吸干，切片依次通過10%甲醛5～10s×2次和2%甲醛5～10 s，期間不斷搖動切片；蒸餾水速洗，濾紙吸干；滴加氨銀液顯色20～30 s；氨銀液配置（向20% AgNO3中滴加氫氧化銨，邊加邊搖勻，至溶液轉(zhuǎn)至澄清即停止，用前配置）；切片放入1%甲醛10～30 s，鏡下可見清晰的棕褐色神經(jīng)末梢即終止。上行脫水、透明，樹膠封片；在Leica DMLA顯微鏡下觀察并分析AchE－鍍銀染色切片，每張切片取5個視野，40×物鏡下分析神經(jīng)末梢支配情況。

1.2.4 熒光組織化學(xué)染色

選切片置于PBS中振蕩漂洗15 min×3次；濾紙吸干，用免疫組化筆標(biāo)記輪廓，滴加羅丹明標(biāo)記的α-BTX（1∶100，PBS稀釋），置濕盒內(nèi)室溫避光染色1 h；PBS振蕩漂洗15min×3次；無熒光甘油封片。在Leica DM4000 B熒光顯微鏡下觀察和采集羅丹明標(biāo)記的運動終板圖像，40×物鏡下每張切片取5個視野，在每個視野中選取清晰的運動終板圖像，用Leica Qwin圖像采集分析系統(tǒng)測量終板面積和終板周長。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 運動終板AchE染色圖像

圖1和圖2顯示了3～8周齡大鼠腓腸肌運動終板AchE染色圖像。圖1中放大50倍光鏡下清晰可見，大鼠腓腸肌NMJ在肌腹上呈典型的倒V形分布。由圖2可見，在放大400倍光鏡下，運動終板為棕紅色橢圓形態(tài)，均勻地集中分布在每條肌纖維上。

圖1 對照組3周齡大鼠腓腸肌運動終板AchE染色圖像（×50）

2.2 運動終板計數(shù)及神經(jīng)支配特征

多因素方差分析顯示，周齡和運動干預(yù)對運動終板計數(shù)均有影響（P<0.01，P<0.05）。5周齡對照組運動終板數(shù)量顯著低于4周齡對照組 （P<0.01），之后各組間運動終板數(shù)量無顯著差異；懸吊組4周齡和5周齡時運動終板計數(shù)顯著低于同齡對照組 （P< 0.05），運動組運動終板數(shù)量與C組無差異（見表1）。

在放大400倍光鏡下清晰可見運動神經(jīng)末梢分支支配運動終板的情況（圖3和圖4）。分析各周齡圖像發(fā)現(xiàn)，從3周齡開始，NMJ神經(jīng)支配特征是典型的單神經(jīng)支配。結(jié)果未見運動組及懸吊組與對照組間具有顯著差異。

2.3 運動終板形態(tài)測量結(jié)果

圖5顯示了各組大鼠腓腸肌運動終板的熒光染色圖像。比較各組運動終板形態(tài)，可以看到隨著周齡增長，終板形態(tài)總體增大；相同周齡運動組運動終板大于同齡對照組，皺褶豐富；懸吊組終板小于同齡對照組，皺褶呈萎縮狀態(tài)。每張熒光染色切片選取5個視野測量運動終板面積和周長，方法如圖6所示，結(jié)果見表2。

多因素方差分析顯示，周齡和運動干預(yù)對成長期大鼠腓腸肌終板面積和周長均有顯著影響（P<0.01）。對照組4周齡終板面積較3周齡增長了56.14%（P<0.01），對照組6周齡較5周齡增長了38.41%（P<0.01），對照組8周齡較6周齡增長了29.51%（P<0.01）；對照組4周齡終板周長較3周齡增長了47.53%（P<0.01），對照組6周齡較5周齡增長了34.07%（P<0.01），對照組8周齡較6周齡增長了18.92%（P<0.01）。運動組5周齡、6周齡和8周齡終板面積均顯著大于同齡對照組（P<0.01），懸吊組4周齡、5周齡、6周齡、8周齡運動終板面積均顯著低于同齡對照組（P<0.01），終板周長具有相似的特征（見表2）。

圖2 對照組4、5、6、8周齡大鼠腓腸肌運動終板AchE染色圖像（400×）

表1 各組成長期大鼠腓腸肌運動終板計數(shù)比較（單位：個/400倍視野）

圖3 對照組3周齡大鼠腓腸肌運動終板及神經(jīng)末梢AchΕ-鍍銀染色圖像（400×）

2.4 AchE含量

多因素方差分析可見，周齡是影響腓腸肌AchE的主要因素（P<0.01），運動干預(yù)無顯著影響。正常發(fā)育下，對照組4周齡AchE染色OD值顯著高于3周齡（P<0.01），對照組5周齡AchE染色OD值顯著低于4周齡（P<0.01）；至8周齡時，運動組及懸吊組與對照組間無顯著差異（見表3）。

3 討論

圖4 對照組4、5、6、8周齡大鼠腓腸肌運動終板神經(jīng)支配情況AchΕ-鍍銀染色圖像（400×）

圖5 各組成長期大鼠腓腸肌運動終板熒光染色圖像（羅丹明標(biāo)記的α-BTX熒光染色運動終板，400×）

圖6 熒光染色的運動終板圖像測量方法示例

表2 各組成長期大鼠腓腸肌運動終板測量結(jié)果

表3 各組成長期大鼠腓腸肌AchE染色OD值

本研究發(fā)現(xiàn)，4周齡時運動終板計數(shù)顯著減少，腓腸肌AchE含量增多，這表明多神經(jīng)支配向單神經(jīng)支配及多余突觸消退過程在大鼠出生后3～4周內(nèi)基本完成。以往關(guān)于出生后NMJ發(fā)育的研究多將其定位于出生后很短的一段時間，如Elaine等通過觀察胸鎖乳突肌將成熟型運動終板出現(xiàn)的時間定為大鼠出生后第2周以前［11］。本研究綜合運動終板染色圖像及終板計數(shù)結(jié)果，認(rèn)為腓腸肌運動終板在出生后的發(fā)育高峰是出生后3～4周，這種差異的原因可能是胸鎖乳突肌和腓腸肌雖然同屬骨骼肌，但其各自功能不同。胸鎖乳突肌主要與呼吸時的胸廓運動以及前肢取食動作有關(guān)，其發(fā)育可能較腓腸肌略早。腓腸肌NMJ發(fā)育則與大鼠運動能力的發(fā)展過程相適應(yīng)。SD大鼠出生后10天開始爬行，出生后2周可以行走，伴隨著下肢運動能力的增強(qiáng)，是腓腸肌NMJ完成出生后發(fā)育的活躍期，得到保留的運動終板逐漸呈現(xiàn)出皺褶和分支狀態(tài)，最終每個肌細(xì)胞獲得一對一的高效率神經(jīng)支配。關(guān)于NMJ突觸消退的機(jī)制一直是研究熱點，但觀點不一?？赡軄碜酝挥|前、突觸后、施旺氏細(xì)胞的很多成分連同神經(jīng)營養(yǎng)因子均參與了這個過程，消退的多余神經(jīng)軸突可能被施旺氏細(xì)胞吞噬清除［12］。

本研究觀察到，大鼠5周齡以后出現(xiàn)第2次運動終板形態(tài)顯著增長的現(xiàn)象。查閱以前研究，無類似文獻(xiàn)支持。大鼠出生后到3周齡為幼年期，8周齡以后為成年期，青春期則是大鼠出生后5～8周齡［13］，故推測本研究觀察到的第2次快速發(fā)育過程與青春期發(fā)育有關(guān)。大鼠生長發(fā)育有兩個快速增長時期--幼年期和青春期，NMJ形態(tài)出現(xiàn)的第2次發(fā)育高峰可能是青春期為適應(yīng)身體快速增長和運動能力向成年狀態(tài)轉(zhuǎn)化而出現(xiàn)的。研究表明，大鼠腓腸肌重量增長在整個成長期均呈持續(xù)單一的增長趨勢［14］，并無與運動終板類似的階段性顯著增長的發(fā)育特征，這提示運動能力提高雖以肌纖維持續(xù)發(fā)展為基礎(chǔ)，但神經(jīng)肌肉控制能力的階段性變化才可能是運動能力快速提高的重要原因。

運動刺激在NMJ形態(tài)發(fā)育特別是兩個發(fā)育高峰期起到重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，運動組成年時運動終板顯著大于對照組（P<0.01），而懸吊組則顯著小于對照組（P<0.01），表明運動干預(yù)改變了運動終板面積和周長，使運動終板面積和周長高于同齡對照水平，抑制運動則使終板面積和周長顯著低于正常水平。也有學(xué)者認(rèn)為在這個過程中，突觸前膜神經(jīng)末梢改變比運動終板變化明顯，運動訓(xùn)練未引起Ach囊泡數(shù)量及nAchR密度改變，而主要引起神經(jīng)末梢增多［15］。本研究并未在運動組觀察到突觸前神經(jīng)末梢分布增多和支配增強(qiáng)的現(xiàn)象，故推測運動不會影響神經(jīng)末梢與運動終板之間的匹配關(guān)系，以保證突觸傳遞的穩(wěn)定性，NMJ形態(tài)的改變可能更多地與運動終板上其它輔助性功能性蛋白成分的變化有關(guān)，也可能由于運動使NMJ在肌纖維上的排列更為分散所致。

關(guān)于運動終板結(jié)構(gòu)成分是否受運動干預(yù)的影響，目前爭議較大。有觀點認(rèn)為運動可以改變NMJ突觸后膜nAchR的數(shù)目，運動訓(xùn)練的影響主要表現(xiàn)在nAchR數(shù)量和AchE活性改變［16］。AchE是NMJ重要的結(jié)構(gòu)成分之一。本研究發(fā)現(xiàn)在正常發(fā)育過程中，AchE于出生后4周顯著增多，隨后下降，至成年基本保持穩(wěn)定，這個進(jìn)程在時間上與NMJ形態(tài)第一個發(fā)育高峰相對應(yīng)，以適應(yīng)NMJ神經(jīng)傳遞功能發(fā)育的需要。此時nAchR大量表達(dá)已經(jīng)基本完成，多神經(jīng)支配已經(jīng)轉(zhuǎn)化為單神經(jīng)支配，多余NMJ消退，AchE含量增加是功能適應(yīng)的結(jié)果。盡管AchE含量和活性在成長期有所增長，但在一定程度上又是相對穩(wěn)定的。有研究通過熒光追蹤成年大鼠在體NNJ內(nèi)的AchE，也發(fā)現(xiàn)突觸間隙的AchE數(shù)量和密度相對穩(wěn)定，而蛋白聚糖復(fù)合物α-營養(yǎng)因子缺失的大鼠，其突觸間隙AchE丟失率則顯著上升，因此，前者可能對保持NMJ中AchE含量及神經(jīng)肌肉功能穩(wěn)定性十分關(guān)鍵［17］，成年后AchE對神經(jīng)肌肉功能的影響主要以活性的改變來實現(xiàn)［18］。本研究中，運動干預(yù)對AchE含量無明顯影響也說明了這個問題。

4 總結(jié)

NMJ形態(tài)在出生后早期及青春期各有一次增長高峰，出生后早期的增長高峰結(jié)束以終板計數(shù)顯著減少和AchE含量顯著升高為標(biāo)志；運動可以在一定程度上促進(jìn)成長期NMJ形態(tài)發(fā)育，抑制運動則使NMJ形態(tài)萎縮，發(fā)育延遲，但不影響AchE含量，以保持NMJ自身基本結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。

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Effects of Physical Activities on Development of Neuromuscular Junction of Rats in Grow th Period

An Nan，Zhang Li，Xu Jianfang，Lu Yingli，Zhao Peng，Zhao Jiexiu，He Zihong，F(xiàn)eng Lianshi
China Institute of Sports Science，Beijing，China 100061

An Nan，Email：cfaannan@yahoo.com.cn

Purpose The aim of this study was to investigate the characteristics of neuromuscular junction（NMJ）development of rat in growth period（from weaning to sexualmaturity）.Methods3-week-old male Sprague-Dawley ratswere divided into control group（C）training group（T）and hanging group（H）.Hyperkinesia（treadmill-running）and hypomotility（tail-suspension）interventionswere introduced to group T and group H respectively.The morphology，number，area，perimeter and acetylcholinesterase（AchE）content in end plates weremeasured by fluorescent and histochemistry staining at 3，4，5，6 and 8 weeks of age and compared among groups.ResultsThe development of end platemorphology was affected both by age and exercise intervention.The area and perimeter of end plate at 4 weeks of age were significantly greater than that at 3 weeks of age（P<0.01），and greater at 6 weeks of age than that at5 weeks of age（P<0.01）.The end plate number of group H was less than that of group C at 4 and 5 weeks of age（P<0.05）.AchE contentwas affected only by age，and was higher at 4 weeks of age than that at 3 weeks of age（P<0.01），while the end plate number at 4 weeks of age was less than that at 3 weeks of age（P<0.01）.ConclusionNeuromuscular junction grows significantly both inearly period after birth and in adolescence of rats.The structural component-AchE content significantly increases in early period after birth and remains stable thereafter.Though exercises promote the growth of neuromuscular junction to some extent particularly in the sensitive period of development，but do not affect the stableness of AchE content.

neuromuscular junction，growth period，development，morphology

2012.07.31

國家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)費課題（項目編號06-17）

安楠，Email：cfaannan@yahoo.com.cn，Tel：010-87182522