王小娟李建華邊仁秀

1 浙江工業(yè)大學(xué)體育軍訓(xùn)部（浙江杭州 310014）

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科

有氧運動對2型糖尿病大鼠腓腸肌氧化應(yīng)激及MAPKs信號通路的影響

王小娟1李建華2邊仁秀2

1 浙江工業(yè)大學(xué)體育軍訓(xùn)部（浙江杭州 310014）

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科

目的：研究有氧運動對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗、腓腸肌氧化應(yīng)激以及MAPKs信號通路的影響。方法：健康雄性Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組（C組）、糖尿病對照組（DC組）和有氧運動組（DE組），其中C組以普通飼料喂養(yǎng)，DC組和DE組以高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，對DC組和DE組大鼠采用單次注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法建立2型糖尿病大鼠模型，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周后，DE組大鼠進行無負重游泳訓(xùn)練6周，訓(xùn)練期間C組大鼠繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)，DC組和DE組大鼠繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)。6周后，處死所有大鼠，測試空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），測試腓腸肌超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性及丙二醛（MDA）水平，RT-PCR法測試腓腸肌p38和JNK mRNA表達，Western-blot法測試腓腸肌ERK1/2和p-ERK1/2表達。結(jié)果：和C組相比，DC組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均顯著升高，腓腸肌SOD和GPX活性顯著降低而MDA水平顯著升高，腓腸肌p38、JNK1、JNK2 mRNA相對表達量顯著升高，p-ERK1、ERK2和p-ERK2相對表達量顯著升高而ERK1相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與DC組相比，DE組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均顯著降低，腓腸肌SOD和GPX活性顯著升高而MDA水平顯著降低，腓腸肌p38和JNK1 mRNA相對表達量顯著升高而JNK2 mRNA相對表達量無統(tǒng)計學(xué)意義，腓腸肌p-ERK1、ERK2和p-ERK2相對表達量顯著升高而ERK1相對表達量無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：有氧運動可激活糖尿病大鼠腓腸肌MAPKs信號通路系統(tǒng)，增強機體抗氧化酶SOD和GPX活性，改善糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低其胰島素抵抗水平。

有氧運動；2型糖尿病；氧化應(yīng)激；MAPK信號通路

氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥中的作用逐漸引起重視。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生和抗氧化防御體系之間失衡，導(dǎo)致組織損傷的一種狀態(tài)。2型糖尿病患者體內(nèi)的高脂肪酸、高糖誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多自由基，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生諸多炎癥因子如TNF-α和IL-6等，這些炎癥因子對糖尿病發(fā)生發(fā)展有重要影響。糖尿病發(fā)病后，持續(xù)高血糖進一步加重氧化應(yīng)激，而氧自由基大量堆積又加重糖尿病病情，形成惡性循環(huán)［1］。絲裂原活化蛋白激酶信號系統(tǒng)（MAPKs）是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸雙重磷酸化蛋白激酶家族，它存在于大多數(shù)原核生物和所有真核生物中，在細胞生物信號傳導(dǎo)中起著非常重要的作用。MAPKs家族由ERK1/ 2、JNK、p38、ERK3/4、ERK5等5種亞類組成［2］。其中對ERK1/2、JNK、p38研究得最深入。ROS可通過激活MAPKs信號通路，調(diào)節(jié)抗氧化酶基因等氧化還原敏感型基因表達，使細胞產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)，以抵抗更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。本研究采用單次注射鏈脲佐菌素（STZ）方法建立2型糖尿病大鼠模型，研究有氧運動對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗和氧化應(yīng)激的影響，探討運動誘導(dǎo)MAPKs信號通路變化與2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和胰島素抵抗的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 動物造模與分組

健康雄性Wistar大鼠30只，體重（191.84±16.53）g，購于上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（滬）2003-0002，用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后隨機選8只作為正常對照組（C組），普通飼料喂養(yǎng)；其余22只大鼠改用高脂飼料喂養(yǎng)（高脂飼料配方為基礎(chǔ)飼料60%，蛋黃粉5%，蔗糖20%，豬油15%），并進行糖尿病造模。造模大鼠高脂飼養(yǎng)4周后禁食12 h，將鏈脲佐菌素溶于0.1mol/L枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液（pH 4.2）溶液中，配成濃度為1%的溶液，單次腹腔注射30mg/kg體重，對照組8只大鼠給予等量枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖>16.7 mmol/L為造摸成功。共17只大鼠造模成功并納入實驗，繼續(xù)高脂飲食4周后隨機分為2組：糖尿病對照組（DC組，n=8）和有氧運動組（DE組，n=9）。實驗期間，動物自由攝食和飲水，環(huán)境溫度（20±2）℃，光照12 h/12 h明暗周期。本實驗在浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院完成。

1.2 運動方案

C組和DC組大鼠籠中正常飼養(yǎng)。DE組大鼠進行無負重游泳訓(xùn)練，第1天運動25min，第2天35min，第3天45min，從第4天開始每天運動60min，每周6天，共6周。游泳池為90 cm×70 cm×70 cm的長方體，水深50 cm，水溫（30±1）℃。整個訓(xùn)練期間，C組大鼠繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)，DC組和DE組大鼠繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)。

1.3 取材

于DE組大鼠6周訓(xùn)練結(jié)束后，所有大鼠禁食12 h。戊巴比妥鈉腹腔麻醉，開胸，胸主動脈取血10ml，4℃條件下12000 r/min離心1min分離血清，于4℃冰箱保存，待測空腹血糖（FBG）和空腹胰島素（FINS）。將左側(cè)腓腸肌分成三份于液氮中速凍，并于-80℃冰箱保存。第一份測試超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和丙二醛（MDA），第二份測試MAPK信號通路蛋白p38和JNK mRNA表達，第三份測試MAPK信號通路ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達。

1.4 指標(biāo)的測定

1.4.1 血清FBG和FINS測定

用全自動生化分析儀（HITACHI-7020）檢測各組動物血清FBG含量；血清FINS采用放射免疫法測定，試劑盒均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供，嚴(yán)格按試劑盒說明進行操作，并計算胰島素抵抗指數(shù)［HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5］［1］。

1.4.2 腓腸肌SOD、GPX和MDA測定

于-80℃冰箱取出腓腸肌，用4℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，電子天平稱重，按1 g∶10 ml（每克腓腸肌組織加10 ml 4℃預(yù)冷生理鹽水）比例，在冰水溶液中用玻璃勻漿器研磨制成勻漿，4℃3500 r/min離心10 min，取上清液制成10%腓腸肌組織勻漿，然后嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書檢測SOD、GSH-Px活性和MDA水平。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4.3 腓腸肌p38和JNK mRNA表達測定

腓腸肌總RNA抽提參照Trizol試劑盒說明書進行?？俁NA純度和濃度檢測采用NANODROP 2000 spectrophotometer儀，確認OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，并記錄各樣本濃度；瓊脂糖凝膠電泳檢測28s、18s、5s三條帶以鑒定總RNA完整性（如圖1）。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性

將符合要求的RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃，15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；85℃，5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。根據(jù)所要檢測的目的基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢各基因引物序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，各基因引物序列及擴增長度如表1所示。熒光定量PCR擴增反應(yīng)按以下體系進行，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10μl、PCR Forward Primer（10μM）0.4μl、PCR Reverse Primer（10μM）0.4μl、ROX Reference Dye（50×）0.4μl、DNA模板2 μl、加DEPC水使總反應(yīng)體系達到20μl。Real time PCR分三階段，擴增采用三步法，溫度循環(huán)參數(shù)如下：Stage 1（1×）：95℃，1 min （預(yù)變性）。Stage 2（40×）：95℃，15 s；61℃，30 s；72℃，45 s（收集熒光）。Stage 3（1×）：建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，95℃，30 s；61℃，2min；95℃，15 s；每1℃收集熒光。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β-actin基因為內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔCt計算各基因相對表達量。

1.4.4 腓腸肌ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達測定

從-80℃冰箱取出腓腸肌，放入手動組織勻漿器中，按組織凈重∶裂解液=1∶10的比例，加入相應(yīng)體積裂解液進行勻漿，離心收集上清，加入Laemmli樣品緩沖液（按照蛋白樣品∶Laemmli樣品緩=1∶2的比例混合），強力混勻，樣品置100℃水浴箱中加熱5 min，10000 r/min離心10min，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，BCA法測定蛋白總濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，根據(jù)蛋白質(zhì)maker標(biāo)志和目的蛋白的分子量剪膜，5%脫脂牛奶封閉1小時，用PBST洗3遍，將膜在一抗（兔抗鼠）（Sant Cruze公司1∶2000）中孵育，4℃過夜，用PBST洗3遍，加入熒光二抗（1∶2000），在黑色孵育盒中閉光輕搖孵育1.5 h，用PBST洗3遍，將膜放在odyssey熒光凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照，以待測蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的平均密度之比作為待測蛋白相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清FBG和FINS含量及HOMA-IR

由表2可知，與正常對照組相比，糖尿病對照組和有氧運動組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均顯著升高 （P<0.01或P<0.05）。而有氧運動組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR則比糖尿病對照組顯著降低 （P< 0.01或P<0.05）。病對照組相比，有氧運動組大鼠腓腸肌p38和JNK1 mRNA相對表達量顯著升高 （P<0.01），而JNK2 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 各組p38和JNK mRNA相對表達量比較

表2 各組大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR比較

2.2 腓腸肌SOD、GPX活性及MDA含量

由表3可知，與正常對照組相比，糖尿病對照組和有氧運動組大鼠腓腸肌SOD和GPX活性顯著降低 （P< 0.01或P<0.05），而MDA水平顯著升高（P<0.01）。與糖尿病對照組相比，有氧運動組大鼠SOD和GPX活性顯著升高（P<0.01），而MDA水平顯著降低（P<0.01）。

表3 各組大鼠腓腸肌SOD、GPX活性和MDA含量比較

2.3 腓腸肌p38和JNK mRNA表達

由圖2可知，與正常對照組相比，糖尿病對照組和有氧運動組大鼠腓腸肌p38、JNK1和JNK2 mRNA相對表達量顯著升高（P<0.01或P<0.05）。與糖尿

2.4 腓腸肌ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達

由圖3可知，與正常對照組相比，糖尿病對照組大鼠腓腸肌p-ERK1、ERK2和p-ERK2相對表達量顯著升高（P<0.01），而ERK1相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與正常對照組相比，有氧運動組大鼠腓腸肌ERK1、p-ERK1、ERK2和p-ERK2相對表達量顯著升高（P<0.01或P<0.05）；與糖尿病對照組相比，有氧運動組大鼠腓腸肌p-ERK1、ERK2和p-ERK2相對表達量顯著升高（P<0.01或P<0.05），而ERK1相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 各組ERK 1/2和p-ERK 1/2蛋白表達比較

3 討論

3.1 有氧運動對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

2型糖尿病患者典型的代謝特征是胰島素抵抗（IR）。IR是指正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，也就是指機體對胰島素的反應(yīng)減退，主要表現(xiàn)為胰島素敏感組織（肌肉、脂肪組織）葡萄糖攝取減少及抑制肝葡萄糖輸出作用減弱。以往研究表明，有氧運動對肥胖和與肥胖密切相關(guān)的高血糖、高血脂以及胰島素抵抗等癥狀有較好的預(yù)防及改善作用［3-5］。本研究結(jié)果顯示：糖尿病對照組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR比正常對照組均顯著升高，出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗。這說明本研究采用的腹腔注射鏈脲佐菌素結(jié)合高脂飲食的糖尿病造模方法是成功的；而有氧運動組大鼠FBG、FINS和HOMAIR比糖尿病對照組顯著降低，表明有氧運動明顯改善糖尿病大鼠胰島素抵抗，這同有關(guān)研究報道結(jié)果一致［6］。

3.2 有氧運動對2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的影響

糖尿病時體內(nèi)自由基生成增多，這些自由基主要來源于高糖狀態(tài)下線粒體內(nèi)糖、脂肪、體內(nèi)糖基化蛋白質(zhì)的氧化或細胞漿內(nèi)醛糖的還原反應(yīng)［7］。糖尿病患者產(chǎn)生過多自由基，消耗了內(nèi)源性SOD、GPX和過氧化氫酶（CAT），導(dǎo)致抗氧化能力下降［8］。同時，ROS又會進一步升高血糖，加重糖尿病病情，二者彼此影響，形成惡性循環(huán)［9］。本研究結(jié)果顯示：糖尿病對照組大鼠腓腸肌SOD和GPX活性比正常對照組顯著降低，而MDA水平顯著升高。這說明糖尿病大鼠體內(nèi)高脂肪酸、高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多自由基，消耗了內(nèi)源性SOD和GPX，使機體SOD和GPX顯著下降，導(dǎo)致抗氧化能力下降。同時，氧自由基通過與細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細胞結(jié)構(gòu)，生成MDA，使機體MDA含量顯著升高。

運動是一種應(yīng)激。運動中肌肉收縮、氧化物釋放增多和運動引起細胞功能改變等在刺激抗氧化酶基因表達上起重要作用。過度氧化應(yīng)激對機體造成損傷，而適度氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)細胞抗氧化反應(yīng)，有利于預(yù)防更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。耐力訓(xùn)練提高機體SOD和GPX等抗氧化酶活性，從而有效預(yù)防更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。Powers等［10］研究了運動負荷量與骨骼肌SOD活性之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，強度越大和/或每日持續(xù)時間越長的運動，提高骨骼肌SOD活性越明顯。規(guī)律的耐力訓(xùn)練導(dǎo)致運動肌GPX活性增加［11，12］。與SOD相似，GPX升高受運動強度和運動持續(xù)時間影響，運動強度越大和/或持續(xù)時間越長，GPX活性升高程度越大［10，11］。 本研究結(jié)果顯示：有氧運動組大鼠腓腸肌SOD和GPX活性比糖尿病對照組顯著升高，而MDA水平顯著降低。這說明糖尿病大鼠體內(nèi)高脂肪酸、高糖誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多自由基，消耗了內(nèi)源性SOD和GPX，而這并未引起SOD和GPX活性增加，或者引起的SOD和GPX活性增加不足以抵抗自由基對其的消耗。有氧運動作為對機體的一種適宜刺激，相對于糖尿病大鼠體內(nèi)高脂肪酸、高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，有氧運動對機體的刺激是間歇性的，能較好刺激抗氧化酶SOD和GPX活性增加，而又不產(chǎn)生過多自由基，從而適度增強機體抗氧化反應(yīng)，有利于預(yù)防糖尿病大鼠體內(nèi)高脂肪酸、高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

3.3 有氧運動對2型糖尿病大鼠MAPKs信號通路的影響

有研究認為，非力竭性運動通過產(chǎn)生適度氧化應(yīng)激刺激一些抗氧化酶基因表達，這可能與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)［13］。有研究證明，肌肉單次收縮運動，尤其是離心性收縮能激活骨骼肌MAPK通路［14］。耐力訓(xùn)練明顯增加骨骼肌ERK1/2蛋白量［15］，提示運動能激活MAPK在內(nèi)的多種細胞信號通路［16］。人單腿騎自行車可以使運動側(cè)腿部肌肉ERK1/2蛋白表達增加，但不能使非運動側(cè)腿部肌肉ERK1/2蛋白表達增加［17］。而大鼠進行跑臺運動時，骨骼肌ERK磷酸化增高，膈肌ERK活性無變化［18］。這說明運動誘導(dǎo)肌肉ERK磷酸化可能是運動引起肌肉局部變化而不是全身變化的效應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示：糖尿病對照組大鼠腓腸肌p38、JNK1和JNK2 mRNA相對表達量以及腓腸肌p-ERK1、ERK2和p-ERK2蛋白相對表達量比正常對照組顯著升高，而ERK1蛋白相對表達量無明顯變化。這說明糖尿病大鼠體內(nèi)高脂肪酸、高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和產(chǎn)生的ROS主要通過激活MAPKs信號通路，使細胞產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)，以抵抗更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。ROS激活的MAPKs信號通路主要包括p38、JNK1和JNK2基因表達增加以及p-ERK1、ERK2和p-ERK2蛋白表達增加，而對ERK1蛋白表達的作用不明顯。另外，有氧運動組大鼠腓腸肌p38和JNK1mRNA相對表達量以及p-ERK1、ERK2和p-ERK2蛋白相對表達量比糖尿病對照組顯著升高，而JNK2 mRNA相對表達量與ERK1蛋白相對表達量無明顯變化。這說明有氧運動使機體產(chǎn)生適度氧化應(yīng)激，通過激活MAPKs信號通路，增加抗氧化酶SOD和GPX表達，使細胞產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)，以抵抗更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。有氧運動激活的MAPKs信號通路主要包括p38和JNK1基因表達增加，以及p-ERK1、ERK2和p-ERK2蛋白表達增加，而對JNK2基因表達和ERK1蛋白表達的作用不明顯。

4 總結(jié)

2型糖尿病大鼠機體出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗現(xiàn)象和氧化應(yīng)激，且MAPKs信號通路系統(tǒng)被適度激活，但激活的MAPKs信號通路系統(tǒng)不足以抵抗機體的氧化應(yīng)激。

有氧運動可激活糖尿病大鼠腓腸肌MAPKs信號通路系統(tǒng)，使機體抗氧化酶SOD和GPX表達增加，改善糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低其胰島素抵抗水平。

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Aerobic Exercise Reduces the Level of Insulin Resistance in Diabetic Rats

Wang Xiaojuan1，Li Jianhua2，Bian Renxiu2
1 Physical Education Department，Zhejiang University of Technology，Hangzhou，China 310014
2 Sir Run Run Shaw Hospital，College of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou，China 310016 Corresponding Author：Li Jianhua，Email：zjdxsyfkfk@126.com

ObjectiveTo study the effect of aerobic exercise on the insulin resistance，oxidative stress and MAPKs signaling pathway of gastrocnemius in type 2 diabetic rats.MethodsThirty healthy maleWistar ratswere randomly divided into control group（C，normal diet），diabetic control group（DC，high fat diet），and diabetic aerobic exercise group（DE，high fat diet）.After 4 weeks，rats in groups DC and DE were injected with streptozotocin（STZ）for developing type 2 diabetes，and continued feeding high-fat diet for another 4 weeks.Rats in group DE underwent swimming without additional load for 6weeks.All rats were sacrificed after 6 weeks，and the fasting blood glucose （FBG），fasting insulin（FINS），insulin resistance index（HOMA-IR），gastrocnemius superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GPX）activities，and malondialdehyde（MDA）levels were tested or calculated.Gastrocnemius p38 and JNK mRNA expression were determined by RT-PCR，and gastrocnemius ERK1/2 and p-ERK1/2 expression by Western-blotmethod.ResultsCompared with the rats in group C，F(xiàn)BG，F(xiàn)INS，HOMA-IR and MDA levels increased，gastrocnemius SOD and GPX decreased，MDA level significantly increased，mRNA relative expression levels of p38，JNK1，and JNK2 in gastrocnemius significantly increased in rats of group DC.There was no statistical significance in relative expression level of ERK1.Compared with the group DC，F(xiàn)BG，F(xiàn)INS，HOMA-IR and MDA levels decreased，and gastrocnemius SOD and GPX increased，mRNA relative expression level of p38 and JNK1 in gastrocnemius，and relative expression level of p-ERK1，ERK2 and p-ERK2 significantly increased in group DE.There was no statistical significance in the level of ERK1 and JNK2.ConclusionAerobic exercise could activate the MAPKs signaling pathway，increase the expression of antioxidant enzymes SOD and GPX，improve the oxidative stress status in gastrocnemius，and thus reduce the level of insulin resistance in diabetic rat.

aerobic exercise，type 2 diabetes，oxidative stress，MAPK signaling pathway

2012.04.01

浙江省自然科學(xué)基金項目（Y2080042）

李建華，Email：zjdxsyfkfk@126.com