王創(chuàng)云 ，吳 曦 ，王陸軍 ，趙 麗 ，侯雅靜 ，李海燕

（1.山西騰達(dá)種業(yè)有限公司，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032；3.太原市星火技術(shù)發(fā)展中心，山西太原030009）

株型是小麥品種改良的重要目標(biāo)性狀，其中莖稈是最重要的株型性狀。近年來(lái)，隨著植物生物技術(shù)，特別是基于基因芯片的高通量差異表達(dá)分析技術(shù)的迅速發(fā)展，促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的基因表達(dá)譜研究取得了新的進(jìn)展[1]，克隆了一批控制株型性狀的基因，這對(duì)于闡明作物生長(zhǎng)發(fā)育過程的分子調(diào)控機(jī)制、通過分子手段改造株型及開展分子育種具有重要意義。

目前，利用基因芯片技術(shù)分析植物基因表達(dá)譜的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物上[2]，而對(duì)小麥的相關(guān)研究較少。李榮華等[3]采用基因芯片技術(shù)分析了鋁脅迫下小麥的基因表達(dá)譜，馬璐琳等[4]利用Affymetrix芯片分析了DON誘導(dǎo)抗赤霉病小麥品種望水白的基因表達(dá)譜。

本研究利用Affymetrix小麥基因芯片分析了鄭麥9023莖稈伸長(zhǎng)過程中的基因表達(dá)譜，獲得了一批與小麥莖稈伸長(zhǎng)相關(guān)的候選基因，為進(jìn)一步探討小麥莖稈伸長(zhǎng)的分子機(jī)制積累了資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

溫室種植小麥品種鄭麥9023，選取生長(zhǎng)一致的植株用于取材。分別剝?nèi)“喂?jié)前期及拔節(jié)過程中的基部莖節(jié)組織，迅速在液氮中速凍，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。用于基因差異表達(dá)分析的組織材料包括：拔節(jié)前期：拔節(jié)前的基部莖節(jié)組織（V1）、第1節(jié)長(zhǎng)度為2 mm的莖節(jié)組織（V2）；拔節(jié)后期：第1節(jié)長(zhǎng)度為5 mm的莖節(jié)組織（V3）、第1節(jié)長(zhǎng)度為10 mm的莖節(jié)組織（V4）。

1.2 RNA抽提和探針合成

利用TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）方法提取各材料的總RNA，并采用RNeasy Mini Kit（德國(guó)Qiagen公司）純化總RNA，利用One-cycle cDNA SynthesisKit（美國(guó)Affymetrix公司）合成ds cDNA，并用 GeneChip Sample Cleanup Module（美國(guó)Affymetrix公司） 純化該 cDNA。然后按照GeneChip IVT LabelingKit說明書制備生物素標(biāo)記的cRNA，于94℃保溫35 min后進(jìn)行片段化處理，并作為雜交探針用于基因芯片分析。

1.3 芯片雜交及數(shù)據(jù)分析

采用Affymetrix公司的小麥基因組芯片，其中含有代表55 052個(gè)小麥轉(zhuǎn)錄本的61 127個(gè)探針組（http://www.affymetrix.com）。首先，用檢測(cè)芯片（test chip）檢測(cè)片段化cRNA的質(zhì)量。然后取適量cRNA與試驗(yàn)芯片（experimental chip）雜交，按照試驗(yàn)流程進(jìn)行洗滌、掃描后，用Affymetrix Microarray Suite 5.0軟件對(duì)雜交圖像進(jìn)行分析，并對(duì)數(shù)據(jù)均一化。按照芯片上雜交信號(hào)的強(qiáng)弱將基因的表達(dá)情況分為表達(dá)、模糊表達(dá)和不表達(dá)共3種類型，并對(duì)4張芯片的雜交數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.4 基因功能注釋和分類

通過Affymetrix的NetAffx Analysis Center查詢和NCBI的BLASTx分析，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，并通過MIPS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，將候選基因按照功能分類[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥芯片雜交數(shù)據(jù)比較

將拔節(jié)后期的2個(gè)芯片數(shù)據(jù)（V3，V4）分別與拔節(jié)前期的2個(gè)芯片數(shù)據(jù)（V1，V2）比較，得到4種基因表達(dá)差異情況散點(diǎn)圖（圖1）。其更直觀地顯示了小麥拔節(jié)不同時(shí)期基因表達(dá)量的比例信息和信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系。由圖1可知，小麥拔節(jié)前后有一定數(shù)量的基因存在表達(dá)差異（圖1偏離45°中線的點(diǎn)），其中，既有上調(diào)表達(dá)的基因，又有下調(diào)表達(dá)的基因，本試驗(yàn)選取2倍線以外的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為差異性表達(dá)基因。

2.2 小麥莖稈伸長(zhǎng)過程中的基因差異表達(dá)分析

在比較分析小麥拔節(jié)前后基因表達(dá)差異過程中，試驗(yàn)選擇了對(duì)小麥莖稈伸長(zhǎng)研究有意義且表達(dá)差異大于2倍以上的上調(diào)高表達(dá)基因作為研究對(duì)象，以拔節(jié)前期的基部莖節(jié)組織（V1，V2）為對(duì)照，拔節(jié)后期與前期分別比較，2.0倍以上的上調(diào)表達(dá)基因，與V1比較分別有2 708，2 654個(gè)，共有差異基因1 554個(gè)；與V2比較分別有2 169，1 294個(gè)，共有差異基因605個(gè)；4個(gè)比較共有差異基因172個(gè)（表1）。總體來(lái)看，小麥差異表達(dá)主要表現(xiàn)在第1節(jié)長(zhǎng)度2 mm到第1節(jié)長(zhǎng)度5 mm時(shí)期。

表1 小麥莖稈伸長(zhǎng)過程中的基因差異表達(dá)比較分析

2.3 差異表達(dá)基因的功能分類

經(jīng)Affymetrix的NetAffx Analysis Center查詢和NCBI的BLASTx分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)比較中，上調(diào)表達(dá)2倍以上的基因共有172個(gè)，其中的29個(gè)已被注釋（表2）。

表2 小麥拔節(jié)過程中已被注釋的29個(gè)基因

將經(jīng)過注釋的差異表達(dá)基因按照生物學(xué)功能分為6類（表3）。

比較各類型基因的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，已注釋的候選基因中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)、糖代謝、病程相關(guān)蛋白基因占了絕大多數(shù),分別占29個(gè)注釋基因總數(shù)的62.07%，10.34%和13.79%，其他功能基因所占比例較少。在這些表達(dá)變化倍數(shù)較高的基因中，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因最多（18個(gè)），包括8個(gè)MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子，6個(gè)CAF轉(zhuǎn)錄因子，3個(gè)NAC類轉(zhuǎn)錄因子。

表3 小麥拔節(jié)過程中29個(gè)已被注釋基因生物學(xué)功能分類

2.4 小麥莖稈伸長(zhǎng)過程中功能基因的差異表達(dá)變化

從圖2可以看出，變化趨勢(shì)較大的前10個(gè)基因，5個(gè)是與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的MADS-box家族基因，且表達(dá)趨勢(shì)都是隨著小麥拔節(jié)過程逐步加強(qiáng)；3個(gè)是與病程相關(guān)蛋白基因，2個(gè)是與糖代謝相關(guān)基因。其中，變化最大的探針編號(hào)為TaAffx.143995.17.S1_s_at的 LOC543103是 MADS-box家族基因；變化次之的探針編號(hào)為Ta.20121.1.S1_x_at的TaGlb2b是糖代謝相關(guān)基因。

3 結(jié)論與討論

小麥莖稈高度是解決倒伏問題的重要途徑。以往的研究表明，赤霉素（gibberellin，GA）和油菜素類固醇（brassinosteroid，BR）參與節(jié)間的發(fā)育過程，另外，多胺也影響植株的高度[7]。與它們共同參與調(diào)節(jié)莖稈高度的基因主要分為2類，一類影響信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，一類影響生物合成。

轉(zhuǎn)錄因子（反式作用因子）基因是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)基因，其在植物體內(nèi)構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在時(shí)間和空間上協(xié)同控制基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子是能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[8-9]。

本研究中已經(jīng)注釋的29個(gè)與小麥莖稈伸長(zhǎng)相關(guān)的基因中，有18個(gè)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因，所占比例達(dá)到62.07%。這與前人研究結(jié)果相一致[7]。在18個(gè)轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因中，主要包括3類轉(zhuǎn)錄因子：MADS-box，CAF和NAC，其中，基因表達(dá)差異變化趨勢(shì)較大的前10個(gè)基因中，5個(gè)是MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子，且表達(dá)趨勢(shì)都是隨著小麥的拔節(jié)過程而逐步加強(qiáng)，變化最大的LOC543103正是MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子。但它們是否直接或間接參與了小麥的GA，BR和多胺的生物合成，以及它們不同的表達(dá)模式，這些還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，在小麥的拔節(jié)過程中，有多個(gè)MADS-box基因的表達(dá)發(fā)生了變化，并且在莖節(jié)的表達(dá)量較高，變化也較為顯著，這說明MADS-box基因可能參與了小麥莖稈過程中莖節(jié)的伸長(zhǎng)，為進(jìn)一步理解這些基因的功能提供了有利的材料。

［1］ Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Gene networks involved in drought stressresponseand tolerance[J].JExp Bot，2007，58：221-227.

［2］Micheletto S，Rodriguez-Uribe L，Hernandez R，et al.Comparative transcript profiling in roots of Phaseolus acutifolius and P.vulgaris under waterdeficit stress[J].Plant Sci，2007，173：510-520.

［3］李榮華，郭培國(guó).用基因芯片技術(shù)分析鋁脅迫下小麥的基因表達(dá)譜譜[J].生物技術(shù)通訊，2007，18（4）：581-586.

［4］馬璐琳，尚毅，亓增軍，等.利用Affymetrix芯片分析DON誘導(dǎo)抗赤霉病小麥品種望水白的基因表達(dá)譜 [J].麥類作物學(xué)報(bào)，2009，29（6）：959-964.

［5］王創(chuàng)云，王美霞，盧成達(dá)，等.小麥拔節(jié)過程中差異表達(dá)基因WSR1的克隆及序列分析 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（3）：22-24.

［6］ Ruepp A，Zollner A，Maier D，et al.The FunCat,a functional annotation scheme for systematic classification of proteins from wholegenomes[J].Nucl Acids Res，2004，32：5539-5545.

［7］胡珀，天富.植物莖稈性狀形成與發(fā)育的分子基礎(chǔ)[J].植物學(xué)通報(bào)，2008，25（1）：1-13.

［8］王力娜，范術(shù)麗，宋美珍，等.植物MADS-box基因的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（8）：12-18.

［9］李科友，朱海蘭.植物非生物逆境脅迫DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J].林業(yè)科學(xué)，2011，47（1）：124-134.