冀云肖，常 蕓

一次性力竭運動后心肌核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B的變化及其在運動性心肌微損傷發(fā)生中的作用

冀云肖，常 蕓

目的：研究一次性力竭運動后大鼠心肌NF-κ B在基因與蛋白水平的分布及變化規(guī)律。方法：100只健康成年雄性SD大鼠，隨機分為一次性力竭游泳運動組及安靜對照組。應(yīng)用RT-PCR和免疫熒光組化技術(shù)，從mRNA及蛋白水平研究大鼠心肌NF-κ Bp65的在力竭運動后不同時相的分布及表達變化。結(jié)果：對照組NF-κ B主要分布于細胞質(zhì)、細胞膜及血管內(nèi)膜，偶見于細胞核內(nèi)，力竭運動后NF-κ B主要分布于細胞核、細胞膜和血管內(nèi)膜。一次性力竭后6 h左心室NF-κ B p65蛋白含量顯著高于對照組、12 h組、24 h組（P＜0.05）；運動后即刻室間隔NF-κ B p65蛋白含量顯著高于對照組（P＜0.05），非常顯著高于12 h組、24 h（P＜0.01），運動后6 h非常顯著高于12 h組（P＜0.01）；運動后即刻右心室NF-κ Bp65蛋白含量即顯著高于安靜對照組、24 h組（P＜0.05），運動后6 h組顯著高于安靜對照組（P＜0.05）。一次性力竭運動后即刻心肌總的NF-κ Bp65蛋白含量顯著高于對照組（P＜0.05），6 h組非常顯著地高于對照組水平（P＜0.01），運動后12 h組顯著低于即刻組和6 h組。一次性力竭即刻NF-κ Bp65mRNA含量顯著高于一次性力竭24 h組（P＜0.05）；6 h顯著高于對照組、24 h組（P＜0.05）；12 h顯著高于24 h組（P＜0.05）。結(jié)論：一次力竭運動后不同時相心肌NF-κ BmRNA和蛋白表達增加，可介導一系列炎癥反應(yīng)對細胞造成損傷,構(gòu)成運動性心肌微損傷中發(fā)生機制之一。一次力竭運動后心臟各部位改變存有一定差異，其中室間隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快,以室間隔NF-κ B蛋白峰值水平最高,且右心室NF-κ B蛋白改變恢復(fù)最慢。

力竭運動；核轉(zhuǎn)錄因子KappaB(NF-κ B)；心肌微損傷

研究表明，運動作為一種應(yīng)激因素對人體有明顯的的作用，適當?shù)倪\動可以有效地改善心血管功能，使心臟產(chǎn)生一系列有益的適應(yīng)性變化。而大強度運動特別是劇烈運動或力竭運動可造成心肌多方面的損害。運動性心肌微損傷及對人體的影響逐漸成為運動醫(yī)學研究的熱點問題之一，發(fā)生機制目前尚不完全清楚，其發(fā)生過程十分復(fù)雜，涉及心肌缺氧、心血管痙攣、氧自由基、血液黏度增加、MCP-1、低氧誘導因子等眾多因素。

核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（nuclear factor-kappa B, NF-κ B）是一種對缺氧敏感的炎癥反應(yīng)標志物，NF-κ B可與某些基因啟動子（promotor）固定核苷酸序列結(jié)合從而啟動基因轉(zhuǎn)錄。NF-κ B可調(diào)控細胞粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等）、細胞因子（IL-3、I L-6、TNF-α、IL-8等）、化學趨化因子（MCP-1等）、生長因子等多種基因的轉(zhuǎn)錄表達，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等多種生物進程[1]。研究已經(jīng)證實NF-κ B在缺血再灌注心肌損傷中起著關(guān)鍵作用，在運動條件下心肌細胞中NF-κ B的改變還未見研究報道。本文通過檢測大鼠力竭運動后心肌核轉(zhuǎn)錄因子κ B的分布和變化來探討其在力竭運動所致的心肌微損傷中的作用，并為醫(yī)務(wù)監(jiān)督提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康純種雄性SD大鼠100只(維通利華公司)，2月齡，體重（240±20） g，隨機分為一次性力竭運動即刻組、6 h組、12 h組、24 h組及一次性力竭運動的安靜對照組，每組10只。國家標準嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（18±2）℃，光照12 h，相對濕度為40%～55%。

1.2 運動方案

依據(jù)經(jīng)典的Thomas實驗方案建立動物力竭運動致心肌微損傷模型。模型采用PVC特制泳池，規(guī)格為1.6 m×0.8 m× 1.2 m，內(nèi)壁光滑，水深約60 cm，超過大鼠身長2倍，控制水溫在30～33℃。運動組大鼠進入動物房后首先適應(yīng)3 d，然后進行2d適應(yīng)性游泳運動。力竭標準參照Thomas DP的報道[2]，即“大鼠連續(xù)沉入水中超過10 s，撈出后置于平面不能完成翻正反射”。

1.3 取材與樣本制備

一次性力竭運動組分別于運動后即刻、6 h、12 h、24 h取材，安靜對照組同期取材。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(1 ml/100 g體重)麻醉后，開胸后迅速取出心臟，經(jīng)滅菌生理鹽水清洗后，濾紙吸干并稱重，然后尖銳刀片分離心室與心房，取一部分心室滴加OCT包埋劑后置于液氮冷凍20 s，以冠狀面制作冰凍切片，切取7～8 μ m厚的冰凍切片置于-70℃超低溫冰箱備用；另一部分迅速投入液氮中，后轉(zhuǎn)入-70℃超低溫冰箱待用。

1.4 心肌冰凍切片的免疫熒光染色

1.4.1 免疫熒光染色步驟

采用免疫熒光雙標染色方法檢測心肌中NF-κ B的分布及含量。主要試劑：兔抗大鼠NF-κ B p65多克隆抗體美國Santa Cruze公司產(chǎn)品；Dyl i ght標記山羊抗兔二抗美國Jackson公司產(chǎn)品；DAPI細胞核染液購于碧云天生物研究所；山羊血清購自北京中杉金橋公司。具體步驟如下：（1）從-70℃超低溫冰箱取出保存的冰凍切片，室溫復(fù)溫30 min。（2）4℃丙酮固定10 min，PBS漂洗5 min×3次；（3）滴加1：10稀釋的山羊血清，室溫封閉15 min；（4）傾去血清，勿洗，滴加1：5 0稀釋的兔抗大鼠NF-κ B p65多克隆抗體，4℃過夜；（5）取出玻片，傾去一抗，PBS漂洗5 min×3次滴加。（6）滴加1：100稀釋的Dylight標記山羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h后PBS漂洗5 min×3次；(（7）滴加DAPI原液50 μ l/片，室溫孵育6 min，PBS洗5 min×3次。（8）甘油封片。PBS代替一抗作陰性對照。

1.4.2 免疫熒光圖像采集與分析

用Leica As MDW多維活細胞成像工作站采集熒光圖，490 nm激發(fā)FITC，390 nm激發(fā)DAPI，圖像放大200倍觀察并采集熒光圖像。每張切片左心室、室間隔、右心室3個部位各隨機選取縱切心肌纖維3張圖，橫切3張圖，每張切片取18張圖。用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)對其熒光強度進行定量，熒光強度用積分灰度代表，參考陰性對照標本中熒光強度，灰度值在4O～13O之間為蛋白陽性表達。

1.5 心肌RT-PC試驗

1.5.1 心肌總R NA提取

采用硅基質(zhì)吸附法提取心肌總R N A，按照天根生化RNAsimple提取試劑盒說明操作。取5 μ l總RNA加入95 μ l去DEPC水，在分光光度計上分別測定在260 nm和280 nm處的吸光度，計算A260/280的比值，以鑒定RNA的質(zhì)量。

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)天根生化公司Quant Reverse Transcription第一鏈合成試劑盒說明進行操作建立反轉(zhuǎn)錄體系。操作步驟：將隨機引物、10xRT緩沖液、dNTP混合液、RNA free ddH2O2在室溫下解凍后迅速置于冰上，簡短渦旋后簡短離心收集殘留在管壁的液體，配制20 μ l逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系簡短渦旋離心，37℃孵育60 min。

1.5.3 PC R擴增內(nèi)參和目的條帶

NF-κ B p65引物（150bp）：

上游：5`-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3`

下游：5`-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3`

GAPDH引物（284bp）：

上游：5`-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT -3`

下游：5`-TCTGAGTGGCAGTGATGG-3`

在PCR薄壁管中建立20 μ l擴增反應(yīng)體系：Tap Master Mix 10 μ l，NF-κ B p65上下游引物各0.5 μ l，內(nèi)參上下游引物各0.5 μ l，cDNA 1 μ l，ddH2O2 8 μ l總體積為20 μ l。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min；94℃變性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，10個循環(huán)，然后94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，20個循環(huán)；末次延伸72℃ 10 min。

取7 μ l產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。用Bio-rad凝膠成像儀拍攝電泳結(jié)果，并對內(nèi)參照和目的基因條帶做光密度掃描，通過二者的灰度比值來進行相對定量。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS15.0軟件包進行統(tǒng)計分析。組間進行單因素方差分析，結(jié)果均以平均數(shù)±標準差表示，其中P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 一次力竭運動后大鼠心臟各部位NF-κ B p65蛋白表達與分布變化

2.1.1 一次力竭運動后大鼠心臟NF-κB p65分布變化

如圖1可見Dylight標記的NF-κ B p65蛋白呈綠色點狀或條索狀熒光，DAPI標記細胞核呈點狀藍色熒光。正常對照組大鼠心肌NF-κ B p65蛋白主要位于細胞質(zhì)中，細胞膜、血管內(nèi)膜亦有表達，偶見于細胞核內(nèi)（圖A）。一次力竭運動組后熒光斑的數(shù)量、面積和亮度與對照組相比均發(fā)生不同程度的變化，蛋白分布也發(fā)生了相應(yīng)的變化（圖B）。一次性力竭運動后NF-κ B p65蛋白主要表達于細胞核內(nèi)，細胞膜及血管內(nèi)膜熒光斑數(shù)量也增多，亮度增強。

2.1.2 一次力竭運動后大鼠心臟各部位NF-κB p65蛋白表達變化（見表1）

一次力竭運動后即刻大鼠左心室肌NF-κ B p65蛋白含量上升，至運動后6 h達到峰值，顯著高于安靜對照（P＜0.05），隨后NF-κ B p65蛋白含量下降，至運動后12 h、24 h NF-κ B p65蛋白含量已降至略低于對照組水平，顯著低于運動后6 h（P＜0.05）。

一次力竭運動后即刻大鼠室間隔肌NF-κ B p65蛋白含量顯著高于對照組（P＜0.05）；運動后6 h略有下降，至運動后12 h NF-κ B p65蛋白含量降至比對照組更低的水平，與運動后即刻、6 h組比具有非常顯著性差異（P＜0.01）；運動后24 h NF-κ B p65蛋白含量略有回升，顯著低于即刻組（P＜0.0 5）。

一次性力竭運動后即刻右心室NF-κ B p65顯著高于對照組（P＜0.05）；運動后6 h有所下降，仍顯著高于安靜對照組（P＜0.05）；運動后12 h hNF-κ B p65蛋白含量繼續(xù)下降；至運動后24 hNF-κ B p65蛋白含量降至略高于安靜對照組的水平，顯著低于運動后即刻組（P＜0.05）。2.2 一次力竭運動后大鼠心臟總NF-κ B p65mRNA及蛋白的表達變化

圖2、表2顯示，一次性力竭即刻組NF-κ B p65mRNA含量顯著高于一次性力竭24 h組（P＜0.05）。一次性力竭6 h組NF-κ B p65mRNA含量顯著高于對照組、24 h組（P＜0.05）。一次性力竭12 h組顯著高于一次性力竭24 h組（P＜0.0 5）。

如表2顯示，一次性力竭運動后即刻心肌總的NF-κ B p65蛋白顯著高于安靜對照組（P＜0.05），運動后6 hNF-κ B p65蛋白非常顯著地高于對照組水平（P＜0.01），運動后12 h時NF-κ B p65含量顯著低于即刻組和6 h組。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，大強度運動和急性力竭運動可對機體產(chǎn)生不利影響，常導致運動性疲勞與損傷的發(fā)生，尤其是運動性心肌微損傷[3-5]。運動性心肌微損傷表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)和功能的雙重損傷。大鼠力竭運動所致的心肌損傷與臨床缺血再灌注損傷存在較高的相似性，在力竭運動中由于心肌缺血可致心肌產(chǎn)生一定的損傷，而在運動后由于血液供應(yīng)的恢復(fù)，可致心肌產(chǎn)生比運動時更嚴重的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)力竭運動所致的心肌損傷不僅發(fā)生在運動后即刻，而且在運動后3～24 h更為嚴重，即存在逐漸加重的特點[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，力竭運動引起的心肌損傷在6 h的時相較嚴重，24 h后有所減輕，這些特點與臨床上的缺血再灌注損傷具有高度相似性[6]。因此我們稱之為運動性缺血再灌注損傷[7]。因為運動性缺血再灌注損傷主要發(fā)生在運動后24 h以內(nèi)，因此我們選用0、6 h、12 h、24 h幾個時相點研究NF-κ B在心肌微損傷中的作用。

表1 一次力竭運動后各時相大鼠左心室、室間隔、右心室積分灰度值TableⅠ Integral Grey Values of Rat Left Ventricle, Ventricular Septum and Right Ventricle at the Different Phases after One-time Exhaustive Exercise

表2 一次力竭運動后大鼠心臟總的NF-κ B p65mRNA及蛋白的表達變化TableⅡ Changes of the Total NF-κ B p65mRNA and Protein Expression of Rat Heart after One-time Exhaustive Exercise

NF-κ B p可與某些基因啟動子（promotor）固定核苷酸序列結(jié)合從而啟動基因轉(zhuǎn)錄。NF-κ B可調(diào)控細胞粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等)、細胞因子（IL-3、IL-6、TNF-α、IL-8等）、化學趨化因子（MCP-1等）、生長因子等多種基因的轉(zhuǎn)錄表達，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等多種生物進程[1]。在靜息細胞，NF-κ B與其抑制性蛋白I κ B結(jié)合，形成三聚體復(fù)合物以非激活的形式存在于胞漿中。在受到刺激后，I κ B降解，NF-κ B被釋放并轉(zhuǎn)移到細胞核，結(jié)合到靶基因的啟動子或增強子的κ B結(jié)構(gòu)域，使靶基因轉(zhuǎn)錄增強。體內(nèi)NF-κ B的調(diào)控包括：（1）正反饋：NF-κ B活化可增強TNF-α、IL-1 β等的表達，這些物質(zhì)可再次激活NF-κ B，使炎癥信號放大。（2）負反饋途徑：NF-κ B的抑制蛋白也受其調(diào)控，NF-κ B活化后，其抑制蛋白的基因轉(zhuǎn)錄亦被上調(diào)，抑制蛋白增多可避免NF-κ B激活效應(yīng)無限放大，終止炎癥介質(zhì)的生成。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠一次性力竭運動后大鼠心肌NF-κ BmRNA及蛋白含量均表現(xiàn)為先上升后下降的走勢，與運動性缺血再灌注損傷規(guī)律相一致。研究證實，機械刺激、缺氧、自由基、細胞因子等均可激活NF-κ B，但是自由基是NF-κ B最強的激活因素，細胞內(nèi)自由基水平調(diào)控著NF-κ B的激活[8]。Prosenjit Sen等證明氧化應(yīng)激使NF-κ B的轉(zhuǎn)錄明顯增加[9]。大鼠力竭運動自由基含量升高，自由基清除酶活性降低[10,3]。大量生成的自由基包括非脂質(zhì)氧自由基和脂質(zhì)氧自由基，如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等使NF-κ B在缺血階段激活的基礎(chǔ)上被進一步激活，使NF-κ BmRNA及蛋白含量均呈上升趨勢，隨后由于負反饋逐漸增強，對NF-κ B抑制增強，使NF-κ BmRNA及蛋白均下降。NF-κ B含量升高，調(diào)控粘附分子（P-，E-，L-選擇素等）、細胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等）含量升高，中性粒細胞在粘附分子的協(xié)助下可發(fā)生遷移粘附，并可釋放自由基及2 0多種蛋白水解酶，產(chǎn)生廣泛的損傷作用，同時粘附的中性粒細胞變形能力變差，造成毛細血管的機械阻塞，導致微循環(huán)障礙，產(chǎn)生無復(fù)流現(xiàn)象，致使細胞發(fā)生不可逆性損傷和壞死，即再灌流性心肌損傷[11]。除中性粒細胞造成的損傷外，產(chǎn)生的多種細胞因子亦可分別或聯(lián)合產(chǎn)生損傷作用，如：TNF-α可以通過多種途徑影響心肌功能并造成心肌損傷,如抑制心肌收縮功能、誘導心肌細胞凋亡、刺激線粒體產(chǎn)生活性氧、促使PMN的粘附、浸潤、活化；復(fù)血后中性粒細胞的心肌浸潤顯著增加，與TNF-α之間有良好的正相關(guān)性，抑制TNF-α可減少中性粒細胞浸潤減輕心肌損傷[12]；IL-1 β的大量表達亦可表現(xiàn)除細胞毒性。NF-κ B還可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡對細胞造成損傷。NF-κ B可調(diào)控bcl-2、Fas、cmyc、p53、HSP和Caspase等，具有調(diào)節(jié)細胞凋亡功能的蛋白家族酶類的表達[13]，使促凋亡酶與抗凋亡酶的平衡向促凋亡方向發(fā)展，促進細胞凋亡的發(fā)生。常蕓等在研究中發(fā)現(xiàn)大鼠力竭運動后心肌凋亡明顯增加，促凋亡基因表達增多[5]。運動后復(fù)氧階段大量產(chǎn)生的自由基，也可以直接對細胞造成損傷。自由基可攻擊細胞脂質(zhì)膜，造成細胞膜和線粒體膜功能障礙，細胞內(nèi)鈉鈣離子失調(diào)，造成線粒體鈣超載，能量生成受阻，細胞腫脹，膜電位不穩(wěn)，心率失常；自由基還可直接攻擊核酸，引起DNA斷裂、染色體畸變，激活血小板環(huán)化酶，生成大量血栓素A2、促進組織因子生成釋放等從而導致心肌頓抑、血管內(nèi)皮細胞功能障礙、心肌能量代謝障礙甚至引起肌原纖維破壞、線粒體損傷等超微結(jié)構(gòu)的改變。這些損傷性改變可進一步刺激損傷性因素的增加，對心肌產(chǎn)生顯著的損傷作用。在臨床缺血再灌注研究中有較多的試驗證實，抑制NF-κ B可減少缺血再灌注后細胞因子、粘附分子的表達，中性粒細胞的浸潤等損傷性因素的出現(xiàn)，減輕心肌損傷程度。

對大鼠心肌不同部位NF-κ B蛋白含量的比較發(fā)現(xiàn)，大鼠力竭運動后室間隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快，室間隔NF-κ B蛋白峰值水平最高，右心室NF-κ B蛋白消退最慢，但不同時相各部位無顯著性差異。推測室間隔及右心室較左心室易受損，這一推測與以往研究一致[14]。

4 結(jié)論

4.1 一次力竭運動后心肌NF-κ BmRNA和蛋白表達增加，可介導的一系列炎癥反應(yīng)對細胞造成損傷是構(gòu)成運動性心肌微損傷中發(fā)生機制之一。

4.2 一次力竭運動后心臟各部位改變存有一定差異，其中室間隔及右心室NF-κ B蛋白含量升高速度快，以室間隔NF-κ B蛋白峰值水平最高，且右心室NF-κ B蛋白改變恢復(fù)最慢。

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(責任編輯：何聰)

Changes of Myocardial Nuclear Transcription Factor Kappa B and It's Role in Athletic Myocardial Micro-damage after One-time Exhaustive Exercise

JI Yun-xiao, CHANG Yun
(China Institute of Sport Science, Beijing 100061, China)

Objective To study the distribution and variation laws of rat heart muscle NF-κ B in gene and protein level after one-time exhaustive exercise. Method 100 healthy adult male SD rats were divided randomly into one-time exhaustive swimming group and control group. RT-PCR and immunofluorescence technology were adopted to study distribution and expression variations of rat heart muscle NF-κ B p65 at the different phases after exhaustive exercise from mRNA and protein level. Result In control group, NF-κ B mainly distributed in cell plasma, cell membrane and tunic intima, sometimes in cell nucleus. After exhaustive exercise, NF-κ B mainly distributed in cell plasma, cell membrane and tunic intima and cell nucleus. 6 hours after exhaustive exercise, NF-κ B p65 protein level of left ventricle is obviously higher than those of the control group, 12h group and 24h group (P<0.05). The NF-κ B p65 protein level of ventricular septum immediately after the exercise was significantly higher than that of the control group (P<0.05) and was much higher than the 12h group and 24h group (P<0.01). It was much higher than that of the 12h group 6 hours after the exercise. NF-κ B p65 protein level of the right ventricle was distinctly higher than those of the control group and 24h group (P<0.05) and this level of the 6h group was evidently higher than that of the control group (P<0.05). The total NF-κ B p65 protein level of heart muscle immediately after the one-time exhaustive exercise was significantly higher than that of the control group (P<0.05). This level of the 6h group was much higher than that of the control group (P<0.05). And the level of the 12h group was evidently lower than those of the immediate group and 6h group. NF-κ B p65mRNA level immediately after the one-time exhaustive exercise was clearly higher than that of the 24h group in one-time exhaustive exercise (P <0.05). The level of the 6h group was obviously higher than those of the control group and 24h group (P<0.05). The level of the 12h group was significantly higher than that of the 24h group (P<0.05). Conclusion The increase of heart muscle NF-κ BmRNA and protein expression at the different phases after the one-time exhaustive exercise may lead to a series of inflammatory reaction that can damage the cells. This is one of the occurrence mechanisms of athletic myocardial micro-damage. There is a difference in the changes of the different parts of heart after one-time exhaustive exercise. NF-κ B protein levels of ventricular septum and right ventricle rise quickly. NF-κ B protein level of the ventricular septum reaches the highest and the recovery of right ventricle NF-κ B protein changes is the lowest.

sports, power; constitution; science & technology; public service system; culture

G804.5

A

1006-1207(2012)04-0025-05

2012-06-27

國家體育總局體育科學研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費（10-01）

冀云肖，男，研究生. 主要研究方向：運動心臟病理與醫(yī)學監(jiān)督.

國家體育總局體育科學研究所，北京體育館路11號，北京100061