王偉平， 劉池波

(1臺州市第一人民醫(yī)院檢驗科，浙江臺州318020;2臺州市立醫(yī)院檢驗科，浙江臺州318000)

胃腺癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一［1］，占 我國惡性腫瘤死亡的23.2%，每年死于胃腺癌的人數(shù)約為16萬［2］，大部分胃腺癌患者就診時已屬中晚期。目前臨床胃腺癌的診斷方法多是物理診斷和組織細胞學診斷，這些方法往往只能發(fā)現(xiàn)中期病例，并且操作繁瑣，因此只能靠生物化學方法檢測胃腺癌發(fā)生過程中表達的特異性蛋白標志物達到快速診斷的目的。但是至今沒有一種標志物對胃腺癌是完全特異性的，如現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的胃腺癌相關標志物癌胚抗原、糖鏈抗原19－9、糖鏈抗原125等診斷，靈敏度不高，特異性不強，尚不足于用來進行早期診斷［3］。因此，探索和建立一種簡單、快速、敏感性高和特異性強的胃腺癌快速診斷技術已經(jīng)成為臨床醫(yī)學上亟待解決的問題。表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(surface－enhanced laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry，SELDI－TOF－MS)是近年來出現(xiàn)的一種新型的蛋白質組學研究方法［4－6］，可用于直接檢測臨床各種類型標本，如血清、尿液、腦脊液等，實現(xiàn)了質譜技術用于臨床樣本檢測的飛躍［5，7］。我們利用 SELDI－TOF－MS 技術結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI－TOF－MS)，對109例胃腺癌和106例對照組(60例健康者、30例慢性淺表性胃炎和16例慢性萎縮性胃炎)進行蛋白質組學分析，篩選出胃腺癌特異的蛋白質標志物，并用質譜鑒定技術對篩選的胃腺癌相關蛋白進行鑒定分析。

材料和方法

1 研究對象

109 例胃腺癌患者按照Dukes分類(其中Dukes A 25例，Dukes B 22例，Dukes C 28例，Dukes D 34例)，所有胃腺癌的術前血清來自浙江大學附屬第一醫(yī)院和浙江省臺州市立醫(yī)院。106例對照血清來自浙江省臺州市立醫(yī)院(慢性淺表性胃炎30例，慢性萎縮性胃炎16例，健康者60例)。按照表1分成實驗組與驗證組。實驗經(jīng)本院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。所有胃腺癌、慢性淺表性胃炎和慢性萎縮性胃炎患者均經(jīng)2位病理學專家證實。所有外周血標本均在清晨空腹采血，采集后立即放入 4℃冰箱內靜置 1～2 h，然后 4℃3 000 r/min離心10 min，分離血清后，在冰上將血清轉移到新的PCR管中分裝，放入－80℃內冰箱保存待檢。

2 儀器和試劑

乙腈、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(sinapinic acid，SPA)、尿素、DTT、CHAPS、Tris－HCl、H2O 等購自Sigma。SELDI－TOF－MS(PBS IIC)質譜儀購自Ciphergen Biosystems。Q10蛋白芯片購于 Bio－Rad。MALDI－TOF－MS質譜儀(AXIMA CFRTMplus)購于Kratos Analytical。高相液相色譜(high－performance liquid chromatography，HPLC)購于島津 Shimadzu。Xcalibur的程序組件Bioworks 3.2數(shù)據(jù)庫購自Thermo Finnigan。

表1 109例胃腺癌患者臨床分組和106例對照組情況Table 1.Clinical Dukes stage of 109 patients with gastric adenocarcinoma and 106 control

3 胃腺癌SELDI－TOF－MS分析

血清經(jīng)冰浴融解后4℃ 10 000 r/min離心10 min。取 20 μL 血清加 30 μL U9 緩沖液(9 mol/L尿素，2%CHAPS，1%DTT)，4 ℃ 振搖 20 min，再加100 μL U1緩沖液(50 mmol/L Tris－HCl緩沖液9倍稀釋U9緩沖液)，4℃振蕩30 min。每個芯池中加200 μL Q10 緩沖液(100 mmol/L Tris－HCl緩沖液，pH 9.0)，振蕩孵育5 min 2次。從上述蛋白變性后的血清樣品中取50 μL，加200 μL Q10緩沖液稀釋，加至Q10芯片的Bioprocessor(Ciphergen)中，振蕩60 min，甩去血清標本，每孔加 200 μL Q10緩沖液，振蕩孵育5 min 2次，最后芯片用20 mmol/L HEPES(pH 7.4)淋洗，晾干芯片。芯片每孔分2次加 SPA 0.5 μL，2次之間自然晾干。質譜儀參數(shù)設定為激光強度185，靈敏度8，優(yōu)化范圍2 000～20 000質荷比(m/z)。每條芯片取1點用同一正常人血清作內參照，芯片間變異系數(shù)CV≤10%。檢測前用All－in－One多肽標準芯片校正，系統(tǒng)質量偏差≤0.1%。原始數(shù)據(jù)先以ProteinChip 3.0軟件校正。

4 蛋白質的純化分析

將血清溶解后取出100 μL血清，加入350 μL水，700 μL純乙腈。將上述混合液體置入－20℃的冰箱內，30 min后取出，3 000 r/min離心10 min。上清液轉入PCR管中凍干20 min。將凍干的樣品上樣至HPLC中。收集不同時間的純化液體，將純化出的蛋白液置入PCR管中凍干約20 μL。各取所收集組分 0.5 μL，分別加入 1.5 μL 基質溶液(10 mg/L CHCA)，混合后點于靶板上，靜置結晶、干燥后用MALDI－TOF－MS檢測。檢測條件:脈沖氮激光(337 nm)作為離子解吸電離源，加速電壓20 kV，采用線性分析模式，質量范圍:3 000～20 000(m/z)。找出SELDI－TOF－MS所篩選質荷峰值的特異樣本。

5 目標蛋白質的LC－MS/MS分析

取20 μL純化的目標蛋白質，加60 μL 8 mol/L尿素，使尿素的終濃度為6 mol/L，室溫振蕩20 min;加入 0.8 μL 1 mol/L DTT，使其終濃度為 10 mmol/L，室溫振蕩1 h;再加入 3.2 μL 1 mol/L 碘乙酰胺，使其終濃度為40 mmol/L，避光放置45 min;加入3.2 μL 1 mol/L DTT，終濃度為40 mmol/L，振蕩20 min;加入400 μL 50 mmol/L NH4HCO3稀釋樣品溶液，使尿素終濃度降為1 mol/L，pH約8.0。每支樣品中加入0.1 μg蛋白酶 K，37 ℃水浴1 h，加入甲酸調溶液pH＜3，終止酶解反應。目標蛋白的酶解產(chǎn)物用LC－MS/MS進行分析。樣品溶液可以通過特定裝置直接上樣于自制的C18毛細管液相色譜柱。色譜柱及色譜條件:自制毛細管柱內徑為100 μm，填料部分長100 mm，填料粒徑 5 μm;流動相 A:水，0.1% 甲酸;流動相B:乙腈，0.1%甲酸);洗脫程序:100%A(0 min)－100%A(5 min)－5%B(5.1 min)－65%B(60 min)－100%B(75 min)－100%B(85 min);流速:200～800 nL/min。質譜條件:采用數(shù)據(jù)依賴模式(data－dependent mode)，掃描質量范圍:400～2 000(m/z)，每次選取全掃描(full scan)中5個信號最強的離子峰(母離子)進行二級質譜(MS2)分析。

6 LC－MS/MS分析數(shù)據(jù)的檢索

數(shù)據(jù)檢索利用 Xcalibur的程序組件 Bioworks 3.2(Thermo Finnigan)完成，根據(jù)二級離子譜圖在NCBI的人類蛋白數(shù)據(jù)庫(human.ref)中檢索肽段序列。檢索參數(shù)設置:酶切斷裂位點設為隨機，固定修飾為半胱氨酸的胺甲?；揎?，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，檢索參數(shù) ΔCN ＞0.1;Sp＞500;Rsp≥5;Xcorrvs Charge:Xcorr(+1)＞ 1.9、Xcorr(+2)＞ 2.5、Xcorr(+3)＞3.75。

7 統(tǒng)計學處理

胃腺癌SELDI蛋白指紋圖譜用Biomarker Wizard Software 3.1軟件和 Biomarker Patterns Software 4.0.1軟件進行分組及相關性分析，胃腺癌組與對照組之間蛋白質峰強度比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 胃腺癌血清蛋白指紋圖譜分析

實驗組中65例胃腺癌組和53例對照組血清的蛋白指紋圖譜經(jīng)標準化后，用 Biomarker Wizard軟件分析，在分子質量2 000～50 000范圍內共檢測到227個蛋白峰，見圖1。

Figure 1.Representative protein spectrum of a gastric adenocarcinoma sample detected by SELDI－TOF－MS combined with Q10 protein chip，showing the protein mass/charge ratio between 1 000 and 20 000.圖1 經(jīng)SELDI－TOF－MS結合Q10蛋白芯片檢測的胃腺癌血清蛋白質指紋表達圖譜

2 胃腺癌血清蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)分析及胃腺癌診斷模型的建立

經(jīng)Biomarker Patterns軟件作進一步分析顯示，胃腺癌患者外周血清蛋白質表達譜與對照組相比，m/z為5 906.5、6 635.7 和8 716.3 的3 個蛋白峰的差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，見圖 2、表 2，其中5 906.5 D蛋白峰在胃腺癌組中明顯高于對照組，而6 635.7 D和8 716.3 D蛋白峰則在對照組中相對高表達，見表2。用此模型分析65例胃腺癌與53例對照組的質譜結果，其敏感性為93.85%(61/65)，特異性為94.34%(50/53)，見表3。根據(jù)差異蛋白及其特定組合，理論上可以區(qū)分胃腺癌組與對照組。

3 診斷模型的驗證

采用44例胃腺癌組與53例對照組檢測得到的蛋白指紋圖譜對已建立的胃腺癌診斷模型進行驗證，驗證結果表明其對胃腺癌診斷的敏感性為90.91%(40/44)，特異性為 90.57%(48/53)，見表3。

4 差異蛋白質峰的純化

將胃腺癌3個差異蛋白質峰(m/z 5 906.5、6 635.7和8 716.3)經(jīng) HPLC 分離純化后，收集到不同的PCR管中，經(jīng)MALDI－TOF－MS檢測，發(fā)現(xiàn)3個純化樣本經(jīng)MALDI－TOF－MS檢測后相對分子質量分別是5 906.4、6 632.9 和 8 704.3，見圖3。

5 質譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索

將上述3管的蛋白質樣品酶解后，采用LCMS/MS測定該蛋白質的酶解肽段，數(shù)據(jù)經(jīng)過Xcalibur的程序組件 Bioworks 3.2(Thermo Finnigan)分析。根據(jù)二級離子譜圖在NCBI的人類蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索肽段序列，查得其對應可能的蛋白質為:5 906.4為纖維蛋白原α鏈，所檢測到的肽段氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中的纖維蛋白原α鏈序列匹配率為100%;6 632.9為載脂蛋白 A－II，所檢測到的肽段氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中的載脂蛋白A－II序列匹配率為96%;8 704.3為載脂蛋白 C－I，所檢測到的肽段氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中的載脂蛋白 C－I序列匹配率為60%，見表4。

Figure 2.Differential expression of SELDI peaks with mass/charge ratios of 5 906.5，6 635.7 and 8 716.3 in serum samples from patients with gastric adenocarcinoma(G)and healthy control subjects(C).圖2 建立胃腺癌診斷模型的3個蛋白峰(m/z 5 906.5、6 635.7和8 716.3)的蛋白指紋圖譜

表2 胃腺癌組與對照組血清蛋白質峰強度比較Table 2.Mean signal intensity of various proteins and peptides comparing gastric adenocarcinoma with healthy control(±s)

表2 胃腺癌組與對照組血清蛋白質峰強度比較Table 2.Mean signal intensity of various proteins and peptides comparing gastric adenocarcinoma with healthy control(±s)

＊＊P ＜ 0.01 vs healthy control.

m/z Gastric adenocarcinoma(n=65)Healthy control(n=53)5 906.5 8.53 ±4.33＊＊0.88 ±0.31 6 635.7 6.54 ±2.44＊＊ 17.56 ±4.43 8 716.3 0.93 ±0.29＊＊2.16 ±0.98

表3 胃腺癌診斷模型的診斷特性Table 3.Prediction results of the diagnostic model for gastric adenocarcinoma

Figure 3.MALDI－TOF－MS spectra of the three purified potential protein markers.A:m/z 5 906.5;B:m/z 6 635.7;C:m/z 8 716.3.圖3 m/z 5 906.5、6 635.7 和8 716.3 的3 個差異蛋白經(jīng)蛋白純化后的MALDI－TOF－MS圖

討 論

SELDI－TOF－MS是近年出現(xiàn)的一種新的蛋白質組學研究方法，它集芯片和質譜于一身，是當前臨床蛋白質組學研究中較理想的技術平臺。目前已在自身免疫性疾?。?］、感染性疾病［9］及惡性腫瘤［10］等多種疾病標志物篩選方面取得了突破性進展，并且篩選出許多與疾病相關的新型生物標志物為臨床疾病的診斷和治療等提供了新的選擇［11］。但SELDITOF－MS技術也存在一些缺點，如不同批次的芯片得到的質譜有較大的差異、基線漂移以及高噪音等都可能會降低檢測結果的重復性。其次SLEDITOF－MS技術結合一種芯片所獲得的蛋白并非血清中所有蛋白，只是一種性質的蛋白，因此要想獲得更多蛋白，需要采用多種芯片檢測。最后SLEDI－TOF－MS技術善于捕獲小分子蛋白，因此也見有選用雙向凝膠電泳技術來篩選胃腺癌大分子蛋白的報道［12］作為SELDI技術篩選差異蛋白的互補技術。這些缺點有待我們進一步改善。

在本研究中，我們通過SLEDI－TOF－MS技術結合 Q10 芯片篩選出 m/z 5 906.5、6 635.7 和8 716.3的蛋白質標志物3個，其中5 906.5在胃腺癌血清中高表達，6 635.7和8 716.3在胃腺癌血清中低表達。由這3個標志物組合的診斷模型在檢測胃腺癌的靈敏度為 93.85%(61/65)，特異性為94.34%(50/53)。提示可以將這3個蛋白質標志物作為胃腺癌血清學診斷的指標。通過本研究建立的診斷模型對44例胃腺癌組與53例對照組進行驗證，驗證結果表明其對胃腺癌診斷的敏感性為90.91%(40/44)，特異性為 90.57%(48/53)。由于Q10芯片是一種強陰離子交換芯片，用于分析負電荷蛋白，有別于我們原先報道采用WCX芯片捕獲的正電荷蛋白［13－14］建立的胃癌差異蛋白指紋圖譜，但可將2種芯片聯(lián)合檢測，提高檢測率。

表4 胃腺癌差異蛋白質的氨基酸序列Table 4.Identification of the three potential protein biomarkers with identified peptides and covered sequences

通過本研究，我們鑒定m/z為5 906.5的血清標志物為纖維蛋白原α鏈。纖維蛋白原α鏈是纖維蛋白原的組成部分，與β－鏈及γ－鏈組成纖維蛋白原。FIB是一種糖蛋白，由肝臟細胞合成及分泌，其形成后進入血循環(huán)，是血漿中含量最高的凝血因子，近年研究發(fā)現(xiàn)其與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。纖維蛋白原被激活后轉變?yōu)槔w維蛋白多聚體，具有極強的交織網(wǎng)絡之功能，它可網(wǎng)絡血細胞形成血塊，為腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移提供支架;FIB亦可作為不同黏附分子的配體，增加血小板和腫瘤細胞間的黏附結合，促使腫瘤細胞的侵襲、轉移［15－17］。Ward等［18］應用SELDI技術檢測胰腺癌發(fā)現(xiàn)50%以上的胰腺癌患者纖維蛋白原α鏈片段是升高的。Cheng等［19］應用MALDI－TOF結合磁珠檢測口腔癌，發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原α鏈是口腔癌有用的臨床腫瘤標志物。在動物模型的研究表明，通過強烈抑制纖維蛋白原含量可明顯減少轉移性肺癌的發(fā)生發(fā)展，進而進一步證明了在維持腫瘤細胞的入侵和生存［20－21］方面纖維蛋白原所起的重要作用。同樣，在已發(fā)現(xiàn)的黑色素瘤患者［22］血清中纖維蛋白原鏈肽也有明顯增加?？梢娎w維蛋白原的存在，可能會影響腫瘤的發(fā)展和轉移。

m/z為6 635.7的蛋白為載脂蛋白 A－II，它是人類高密度脂蛋白(HDL)的主要載脂蛋白，其含量占HDL2總載脂蛋白的15%，HDL3總載脂蛋白的25%。載脂蛋白A－II的主要功能是參與脂質的運輸，通過從高密度脂蛋白中轉移載脂蛋白A－I、影響肝脂肪酶、抑制卵磷酯酰化酶的水平，在載脂蛋白 A－II缺乏的情況下，還會引起胰島素代謝紊亂。但發(fā)揮這些功能的具體機制尚未完全清楚。最近越來越多的研究結果表明，APO家族蛋白是其中的關鍵因素。雖然它們在腫瘤發(fā)生中的作用尚未明確，但有證據(jù)表明其與細胞的增殖/凋亡有關［23］。Malik等［24］利用IMAC－Cu芯片研究前列腺癌的標志蛋白，其中的一個標志蛋白就是載脂蛋白 A－II。Xue等［25］利用SELDI技術檢測胰腺癌發(fā)現(xiàn)載脂蛋白 A－II和載脂蛋白 C－I聯(lián)合應用比單用CA199更能提高胰腺癌的診斷能力。可見載脂蛋白A－II與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。

m/z為8 716.3的蛋白為載脂蛋白C－I，主要在肝臟合成，有極少一部分由小腸合成，其主要生物學功能是參與脂類代謝。至今，國內外有關載脂蛋白C－I與腫瘤的相關性研究報道甚少，未見其與胃腺癌的相關報道。Takano等［26］采用SELDI－TOF－MS技術檢測胰腺癌血清，結果顯示，胰腺癌細胞可分泌載脂蛋白C－I，通過抑制載脂蛋白C－I的表達可降低癌細胞復制，誘導癌細胞凋亡。Yang等［27］利用SELDI－TOF－MS篩選非小細胞肺癌患者血清差異蛋白，發(fā)現(xiàn)m/z為 6 628、9 191和11 412的一組蛋白可用于非小細胞肺癌篩查。其中m/z為6628蛋白在非小細胞肺癌中低表達，經(jīng)鑒定為載脂蛋白CI。Engwegen等［28］利用 SELDI－TOF－MS分別檢測了大腸癌血清，得到m/z為6 600和6 630處的蛋白質，經(jīng)鑒定為載脂蛋白 C－I，其在大腸癌和乳腺癌患者血清中低表達。這些關于載脂蛋白C－I在腫瘤患者血清中低表達的研究，與本研究結果相符，這可能是在腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤細胞與宿主相互作用的結果。但其機制尚未清楚，有待進一步研究。

本研究鑒定出的纖維蛋白原α鏈、載脂蛋白 A－II和載脂蛋白 C－I在胃腺癌診斷中的聯(lián)合應用具有較高的特異度和敏感性，且本研究2個肽段與Cohen等［29］報道結果相同，可作為胃腺癌特異診斷指標，具有良好的臨床應用推廣前景。在下一步研究中，我們將進一步擴大樣本量來驗證。

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