曹珊珊， 李瑞芳， 方偉進， 王建剛， 李 艷， 張 博

(河南科技大學醫(yī)學院藥理教研室，河南洛陽471003)

高血壓心肌肥厚是充血性心力衰竭重要的誘因及獨立危險因子，高血壓導致的心肌肥大在體循環(huán)高負荷長期存在時，心肌會發(fā)生失代償，出現充血性心力衰竭，增加死亡率［1］。研究表明，基因轉錄調控功能的紊亂可以促進心肌細胞肥大和胚胎基因表達，從而影響心臟的功能［2］?；蛘{控與組蛋白的乙酰化和去乙?；嘘P，而這一過程主要由組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)調節(jié)。近年來國外有少數學者初步發(fā)現:在心肌肥厚過程中HDACs有可能發(fā)揮著一定的作用［3］。在心肌肥厚的十分復雜的信號網絡中，HDACs是一個重要的下游融合節(jié)點，調節(jié)許多與肥厚相關的轉錄因子表達，可能是治療心肌肥厚的一個很有意義和前景的作用靶標。資料顯示，Ⅰ型HDACs中的HDAC1、2和3可促進心肌肥厚［4］，而HDAC8對心肌肥厚的影響未見報道，故本實驗采用2腎2夾腎性高血壓心肌肥厚模型，觀察左心室肥厚時HDAC8的表達變化以及用丙戊酸鈉(valproic acid sodium，VPA)抑制HDAC8的表達后對心肌肥厚的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 丙戊酸鈉(批號為090415)，購自南開允公藥業(yè);戊巴比妥鈉購自上?；瘜W試劑廠;ExTaq酶、RNase抑制劑、AMV購自TaKaRa;Trizol核酸提取試劑購自 Invitrogen;抗兔的多克隆抗體HDAC8(H-145)(稀釋度1∶500)購自 Santa Cruz，抗鼠的單克隆抗體α-tubulin(稀釋度1∶10 000)購自Sigma。

1.2 動物 體重90～110 g的雄性SD大鼠購自河南省實驗動物中心(合格證號為20100008)。

2 方法

2.1 心肌肥厚模型制備、分組及標本采集 參照文獻［5］方法進行，以1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉，做背部后正中切口，分離腎動脈起始部0.5 cm處放置鈦合金夾。假手術組僅分離腎動脈。術后2周血壓開始上升，排除術后4周血壓小于160 mmHg的大鼠。實驗隨機分為5組，每組10只。(1)假手術組(sham):腹腔注射等量生理鹽水;(2)2腎2夾組(two-kidney two-clip，2K2C):腹腔注射等量生理鹽水;(3)丙戊酸鈉高劑量組(valproic acid sodiumhigh dose，VpaH):術后腹腔注射丙戊酸鈉，400 mg·kg-1·d-1VPA;(4)丙戊酸鈉低劑量組(VpaL):200 mg·kg-1·d-1VPA;(5)坎地沙坦組(candesartan，Can):按10 mg·kg-1·d-1灌胃;術后 4 周開始給藥，連續(xù)給藥4周，所有動物于術后8周摘取心臟，稱取左心室(包括室間隔)重量(left ventricular weight，LVW)，并與體質量(body weight，BW)相除，計算左心室/體重比值(LVW/BW)。取左心室游離壁心肌放入10% 中性甲醛內，24 h后石蠟包埋切片，HE染色。其余心底以及心尖部分放入凍存管中液氮保存。

2.2 常規(guī)蘇木素伊紅(HE)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素室溫染10 min，快速自來水沖洗30～60 s;1%鹽酸乙醇分化1 s，自來水沖洗1 min;伊紅室溫染5～10 min;梯度乙醇脫水;二甲苯透明;中性樹膠封片，光鏡觀察拍照。

2.3 RT-PCR測定心肌組織心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)和 HDAC8 mRNA 表達 用Trizol提取心肌組織中的總RNA，測定總RNA純度和水平，取2 μg總RNA樣本在10μL反應體系中進行反轉錄反應，參照反轉錄試劑盒說明書進行，取cDNA 2 μL參照Taq酶說明書在10 μL體系中擴增。反應條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，65.1℃(ANF)或56.1℃(HDAC8)或52℃(18S)30 s，72℃ 50 s，30個循環(huán)(ANF)或35個循環(huán)(HDAC8)或27個循環(huán)(18S)，72℃ 10 min。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像并讀出電泳帶吸光度值，用目的條帶與18S的吸光度比值來反映目的基因的相對表達量。引物由上海生工合成，ANF上游引物5'-CTG CTA GAC CAC CTG GAG GA-3'，下游引物 5'-AAG CTG TTG CAG CCT AGT CC-3'(Tm:65.1℃，320 bp)。HDAC8上游引物5'-CCA GAA GGT CAG CCA AGA-3'，下游引物 5'-TTC CGT CGC AAT CGT AAT-3'(Tm:56.1℃，267 bp)。18S上游引物5'-GTC CCC CAA CTT CTT AGA G-3'，下游引物5'-CAC CTA CGG AAA CCT TGT TAC-3'(Tm:52 ℃，419 bp)。

2.4 Western blotting測定HDAC8的表達 提取各組心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍進行蛋白定量，并調整上樣量為50 μg，10%SDS-PAGE，PVDF 膜印跡，室溫封閉1 h，Ⅰ抗4℃過夜，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，最后ECL發(fā)光法進行顯色。LabWork 4.0凝膠蛋白分析軟件對條帶進行分析。

3 統計學處理

結 果

1 2腎2夾腎性高血壓大鼠心肌組織中HDAC8的表達變化

圖1A顯示，各組大鼠心肌組織中均有HDAC8的表達，手術后8周，高血壓大鼠左心室的HDAC8 mRNA含量明顯上調，為假手術組的2.8倍(P＜0.05)，高、低劑量丙戊酸鈉均可下調左心室HDAC8 mRNA的水平，分別降至2腎2夾組的50%和61%(P＜0.05)，且具有劑量依賴性。

圖1B顯示，2K2C大鼠左心室HDAC8蛋白的表達水平明顯升高，為假手術組的1.7倍，給予高、低劑量的丙戊酸鈉干預后，HDAC8的蛋白表達明顯減少，分別降為2腎2夾組的約59%和65%。

Figure 1.The mRNA(A)and protein(B)expression of HDAC8 in the left ventricle of the two-kidney two-clip renovascular hypertensive rats after 8 weeks.The experiment was repeated three times with the same result.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham;##P＜0.01 vs 2K2C.圖1 2腎2夾高血壓大鼠左心室HDAC8 mRNA和蛋白的表達變化

2 HDAC8抑制劑對大鼠左心室/體重比值的影響

2腎2 夾縮窄術后，大鼠的體重逐漸增長;給予丙戊酸鈉后對體重增加沒有明顯影響，各組間沒有顯著差異。而表1顯示，2腎2夾組大鼠的左心室/體重比值(LVW/BW)相對假手術組明顯升高(P＜0.05)，提示2腎2夾組大鼠發(fā)生了明顯的左心室肥厚。高劑量丙戊酸鈉可以降低LVW/BW，能明顯緩解這種腎性高血壓引起的心肌肥厚。低劑量丙戊酸鈉也有一定降低LVW/BW作用，但弱于高劑量組。陽性對照藥坎地沙坦可以明顯降低LVW/BW，效果與VPA高劑量組類似。

3 HDAC抑制劑對大鼠心肌組織形態(tài)學的影響

病理切片(HE)染色顯示，與假手術組相比，2K2C組大鼠心肌細胞橫徑和表面積增大，邊緣不規(guī)則，并有心肌細胞排列紊亂，細胞核增大、畸形等改變?？驳厣程菇M明顯抑制這種變化，丙戊酸鈉高劑量組也能抑制這種變化，且效果優(yōu)于低劑量組，見圖2。

表1 各組大鼠2腎2夾術后8周LVW/BW的檢測結果Table 1.Changes of ratio of left ventricular weight to body weight(±s.n=10)

表1 各組大鼠2腎2夾術后8周LVW/BW的檢測結果Table 1.Changes of ratio of left ventricular weight to body weight(±s.n=10)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 2K2C.LVW:left ventricular weight;BW:body weight.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.

Group LVW(mg) BW(g)LVW/BW(mg/g)Sham 460±50 300±13 1.54±0.13 2K2C 600±60* 295±18 2.06±0.25*VpaH 470±40# 300±18 1.61±0.16##VpaL 530±15*# 303±7 1.89±0.29*#Can 460±7## 303±18 1.55±0.18##

Figure 2.Effects of VPA on the histomorphology of left ventricular myocardium 8 weeks after 2K2C operation(HE statining，×200).A:representative transversal section morphology;B:representative longitudinal section morphology.圖2 2腎2夾術后8周丙戊酸鈉對大鼠心肌組織形態(tài)學的影響

4 HDAC抑制劑對大鼠心肌組織中ANF mRNA表達的影響

在術后8周2腎2夾腎性高血壓大鼠中，ANF mRNA的表達為假手術組的3.6倍(P＜0.05)，丙戊酸鈉高、低劑量組均可抑制ANF mRNA的表達，分別降至2腎2夾組的36%和69%(P＜0.05)，見圖3。

討 論

Figure 3.Expression of ANF mRNA in the LV of rats treated with VPA or candesartan.The results were representative of three independent experiments.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham;##P＜0.01 vs 2K2C.圖3 各組大鼠心肌組織ANF mRNA的表達

高血壓左室肥厚是以心肌細胞肥大及成纖維細胞增殖為主要病理學特征的高血壓性臟器損害，因其病因不清、機制復雜，缺乏確切有效的防治措施［6］。近期研究發(fā)現HDACs抑制劑曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)和VPA能夠顯著改善胸主動脈結扎(thoracic aortic banding，TAB)引起的心肌肥大和重構，還可以通過增加組蛋白的乙酰化來調節(jié)心臟肥大基因和胚胎期基因活化［7-8］。在體外培養(yǎng)的心肌細胞中，TSA可以上調α-肌球蛋白重鏈的表達，VPA可以下調HDAC2的表達來防止AngⅡ誘導的心肌肥大反應［9-10］。盡管上述體內和體外實驗表明了HDACs抑制劑具有明顯的抗肥厚作用，但上述體內模型與臨床實際病變存在差距。主動脈結扎模型可以引起心臟后負荷的急劇增加，并不是一種反映高血壓和動脈硬化引起的心臟病變的理想模型，所以我們選用更接近臨床的2腎2夾腎性高血壓模型觀察HDACs抑制劑對心肌肥厚的作用。

目前，國外關于HDACs的研究主要集中在抗癌領域，而在心肌肥厚發(fā)病中的研究主要是通過基因敲除鼠來闡明不同HDACs亞型的功能［11］。我們前期研究發(fā)現在2腎2夾術后6周腎性高血壓大鼠心臟中HDAC2的表達增加同時出現了顯著的心肌肥大和纖維化，提示在腎性高血壓大鼠的心肌重構中，HDACs起了十分重要的作用，但其同工酶HDAC8在2腎2夾腎性高血壓大鼠左心室的表達是否增加，下調其表達對心肌肥厚的影響如何，尚未見報道。

本文在研究2腎2夾腎性高血壓大鼠左心室肥厚的基礎上首次觀察到隨著左室心肌細胞內HDAC8 mRNA和蛋白表達水平上調，心肌肥厚標志性基因ANF在左心室的表達也增加，提示HDAC8可能參與腎性高血壓左心室肥厚發(fā)病過程并促進肥厚的發(fā)展。另外，本研究發(fā)現VPA可以劑量依賴性下調HDAC8 mRNA和蛋白表達，減少ANF mRNA表達，說明VPA在轉錄水平和蛋白水平對HDAC8都起著重要的調控作用。同時VPA治療組左心室肥厚顯著改善，心肌形態(tài)病理學改變得到部分逆轉，左心室重量指數下降。上述結果提示HDACs抑制劑VPA可能通過下調HDAC8的表達逆轉心肌肥厚。總之，我們的結果表明HDAC8參與了腎性高血壓大鼠心肌肥厚的發(fā)病過程，下調其表達可以防止心肌肥厚的發(fā)生。為了進一步揭示HDAC8在心肌肥厚的作用機制，我們接下來將進一步檢測與HDAC8相伴隨的 calcineurin(CaN)和 Akt/GSK3β信號分子及轉錄因子NFATc4、AP-1的表達變化，從基因轉錄的乙酰化修飾調控對心肌肥大的發(fā)病機制進行探討。

［1］ Gallo P，Latronico MV，Gallo P，et al.Inhibition of class I histone deacetylase with an apicidin derivative prevents cardiac hypertrophy and failure［J］.Cardiovasc Res，2008，80(3):416-424.

［2］ 李瑞芳，樂 康，高 潔，等.抑制PPAR-α表達對ET-1誘導的心肌肥大和 PI3K/Akt/GSK3β-NFATc4通路的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(12):2289-2294.

［3］ Nasrin N，Kaushik VK，Fortier E，et al.JNK1 phosphorylates SIRT1 and promotes its enzymic activity ［J］.PLoS One，2009，4(12):e8414.

［4］ Kee HJ，Kook H.Roles and targets of classⅠand Ⅱa histone deacetylases in cardiac hypertrophy［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011:928326.

［5］ 曹珊珊，李瑞芳，方偉進，等.腎性高血壓大鼠模型制作的改良方法［J］.河南科技大學學報，2010，28(3):165-167.

［6］ 席玉慧，孟慶威，徐長慶，等.Sirt1參與異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌肥大［J］.中國病理生理雜志，2010，26(5):844-847.

［7］ Ago T，Liu T，Zhai P，et al.A redox-dependent pathway for regulating class II HDACs and cardiac hypertrophy［J］.Cell，2008，133(6):978-993.

［8］ Cho YK，Eom GH，Kee HJ，et al.Sodium valproate，a histone deacetylase inhibitor but not captopril prevents right ventricular hypertrophy in rats［J］.Circ J，2010，74(4):760-770.

［9］ Kee HJ，Sohn IS，Nam KI，et al.Inhibition of histone deacetylation blocks cardiac hypertrophy induced by angiotensin II infusion and aortic banding［J］.Circulation，2006，113(1):51-59.

［10］ Lu Y，Yang S.AngiotensinⅡinduces cardiomyocyte hypertrophy probably through histone deacetylases［J］.Tohoku J Exp Med，2009，219(1):17-23.

［11］ Kr?mer OH.HDAC2:a critical factor in health and disease［J］.Trends Pharmacol Sci，2009，30(12):647-655.