張麗景， 金成艷， 王果元， 吳 博， 李全鳳， 徐長慶， 田 野， 張 力

(哈爾濱醫(yī)科大學病理生理教研室，黑龍江哈爾濱150081)

心肌重塑是伴隨和加重心力衰竭發(fā)展的一個重要過程，其中心肌纖維化是心肌重塑的一種形式。在心肌纖維化過程中，心肌成纖維細胞增殖，心肌間質(zhì)膠原纖維沉積，心肌僵硬度增加，加重心臟功能障礙。因此揭示心肌成纖維細胞增殖的影響因素及機制是阻斷這一過程的基礎，將為改善心功能提供理論依據(jù)。

心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)是心肌組織中的可分裂細胞，占心臟細胞總數(shù)的近70%。以往認為，CFs不像心肌細胞那樣在心臟的功能中起著關鍵作用，但近年來的研究越來越多地集中到CFs上，并發(fā)現(xiàn)其與心肌細胞相互作用，在心肌細胞的功能調(diào)節(jié)中不可或缺［1－2］。導致心肌纖維化的心肌間質(zhì)Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維主要是由CFs分泌的，而CFs被激活成心肌肌成纖維細胞的關鍵體液因子是血管緊張素 II(angiotensinⅡ，AngⅡ)［3］。但Ang II促心肌成纖維細胞增殖作用的細胞內(nèi)機制不清。而含有Src同源結構域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain－containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP－2)是多種生長因子及細胞因子的細胞內(nèi)共同細胞信號轉導因子，并在促細胞增殖的細胞信號轉導中起正相調(diào)節(jié)作用［4］，因此我們提出假設，即Ang II對心肌成纖維細胞的作用是通過SHP－2調(diào)控的。

SHP－2是一種胞內(nèi)型蛋白酪氨酸磷酸酶，含有2個Src同源結構域，可與磷酸化的酪氨酸殘基結合，并轉導信號，廣泛存在于機體的各種組織和細胞中。大量文獻報道，SHP－2與心臟疾病密切相關［5－7］。為驗證我們的假說，我們在心肌成纖維細胞中過表達SHP－2，另外采用SHP－2的抑制劑，觀察在血管緊張素Ⅱ作用下SHP－2對細胞增殖的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 1～3 d SD大鼠仔鼠，雌雄不限，由哈爾濱醫(yī)科大學動物中心(許可證號為黑動字第80050/009)提供。

1.2 主要試劑 胰蛋白酶、MTT和AngⅡ均購自Sigma;DMEM培養(yǎng)基(高糖)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自 HyClone;腺病毒 Ad－GFP、腺病毒野生型和突變型載體 pAd－GFP－SHP－2、pAd－GFP－SHP－2E76A由美國耶魯大學Anton M.Bennet教授惠贈;SHP－2抑制劑NSC－87877購自Calbiochem;抗波形蛋白(vimentin)抗體購自博士德;免疫組化小鼠二步法檢測試劑盒購自中杉公司。

2 方法

2.1 CFs原代培養(yǎng) 無菌條件下開胸取出仔鼠心臟，剪成4～6塊，加入0.25%胰蛋白酶于37℃消化，所得的全部細胞用培養(yǎng)液懸浮，分種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)90 min，貼壁細胞即心肌成纖維細胞。用完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、青霉素 1×105U/L、鏈霉素 100 mg/L的DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)細胞2～3 d。當融合度達80%～90%，消化傳代。第2～3代細胞用于實驗。

2.2 CFs鑒定 待細胞鋪滿蓋玻片的50% ～70%時，PBS洗5 min×3次，用4%多聚甲醛室溫固定30 min。3%過氧化氫室溫孵育5 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加波形蛋白Ⅰ抗(1∶200)，置4℃冰箱過夜;次日晨 PBS漂洗，加入Ⅱ抗，室溫靜置30 min;3，3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1 min，蘇木素復染。PBS作為陰性對照。

2.3 細胞轉染 在60 mm培養(yǎng)皿中按照1.0×105的密度接種細胞，將重組腺病毒Ad－GFP(GFP組)、野生型Ad－GFP－SHP－2(WT組)、突變型Ad－GFP－SHP－2－E76A(EA組)分別感染心肌成纖維細胞，培養(yǎng)4 h后，補加適當體積的完全培養(yǎng)基。48 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達情況。

2.4 Western blotting 收集細胞，冰上裂解細胞30 min;4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，測定蛋白含量;加入上樣緩沖液沸水中煮沸5 min，進行SDS－PAGE電泳。300 mA恒流轉膜;膜封閉1 h，然后加Ⅰ抗于4℃孵育過夜。次日晨加Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記)在搖床上孵育1 h，然后經(jīng)ECL發(fā)光試劑(Pierce)顯影，最后于暗室X線膠片感光。

2.5 MTT法測定細胞增殖率 細胞以1.0×104cells/well的密度接種于96孔板，待細胞貼壁至細胞融合達70% ～80%后，換無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。轉染48 h、AngⅡ刺激 24 h、NSC－87877作用 24 h后，每孔加入MTT試劑(5 g/L)20 μL避光培養(yǎng)4 h。小心吸棄孔內(nèi)上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL/well，振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm吸光度值。細胞增殖率=(處理組A490/對照組A490)×100%。

2.6 實驗分組 SHP－2過表達對細胞增殖作用分組如下:(1)無轉染對照組(control組);(2)轉染Ad－GFP對照組(GFP組);(3)轉染Ad－GFP－SHP－2野生型組(WT組);(4)轉染Ad－GFP－SHP－2－E76A突變體組(EA組);(5)AngⅡ組;(6)GFP+AngⅡ組;(7)WT+AngⅡ組;(8)EA+AngⅡ組。SHP－2抑制劑NSC－87877對AngⅡ刺激下細胞增殖作用的分組如下:(1)NSC－87877 0 μmol/L+AngⅡ組;(2)NSC－87877 25 μmol/L+AngⅡ組;(3)NSC－87877 50 μmol/L+AngⅡ組;(4)NSC－87877 75 μmol/L+AngⅡ組(AngⅡ濃度均為 10－7mol/L)。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 CFs形態(tài)學觀察及免疫細胞化學鑒定

大部分CFs分離培養(yǎng)90 min后貼壁，呈梭形，分布較均勻，散在生長。CFs生長迅速，2～3 d即呈融合狀態(tài)，胞體大，胞質(zhì)透明，細胞無自發(fā)性搏動，見圖1A。免疫細胞化學染色顯示，我們所分離的CFs波形蛋白呈陽性反應，即胞質(zhì)內(nèi)有大量棕黃色顆粒沉著，胞漿內(nèi)可見棕色絲狀或束狀結構，陽性率在90%以上，見圖1C。PBS作為陰性對照，可見清晰的長梭形細胞形態(tài)，胞漿和胞核藍染，對照呈陰性，見圖1B。

Figure 1.The morphology and identification of rat neonatal cardiac fibroblasts(×100).A:cardiac fibroblasts were cultured for 2 d and observed under a light microscope;B:negative control of immunochemical staining using PBS;C:the positive cells of vimentin immunochemical staining were more than 90%.Scale bar:10 μm.圖1 心肌成纖維細胞形態(tài)及波形蛋白免疫細胞化學染色

2 AngⅡ促進心肌成纖維細胞增殖

AngⅡ在無血清培養(yǎng)下作用24 h。當AngⅡ濃度為10－9mol/L時，細胞的增殖作用明顯高于對照組(P＜0.01)，呈現(xiàn)濃度依賴關系;當AngⅡ濃度達到10－7mol/L時，細胞的增殖率達到最大值(200% ±19%)。當繼續(xù)增大AngⅡ濃度到10－6mol/L和10－5mol/L時，細胞活力反而降低，增殖率分別是191% ±18%和169% ±12%，但與無AngⅡ刺激的對照組相比，依然有明顯的促增殖效果(P＜0.01)，見圖2。因此，我們后續(xù)實驗均采用濃度為10－7mol/L的AngⅡ。

3 SHP－2在CFs中的過表達

重組腺病毒［8］感染CFs時，我們優(yōu)化了感染效率。當感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100時，Ad－GFP、Ad－WT和 Ad－EA感染心肌成纖維細胞的轉染效率都可達到90%左右，見圖3A。

Western blotting結果顯示，GFP組SHP－2的表達與對照組一致，是CFs內(nèi)源性SHP－2的表達;WT組和EA組SHP－2的表達量明顯增多(P＜0.01)，見圖3B。

Figure 2.AngⅡ promoted cardiac fibroblast proliferation in a dose－dependent manner.±sE.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group(AngⅡ=0 mol/L).圖2 MTT法檢測AngⅡ促進成纖維細胞增殖

Figure 3.Overexpression of SHP－2 in cardiac fibroblasts by transfection of SHP－2 adenovirus and detection of expression of SHP－2.A:the transfection efficiency after 48 h of transfection(×40)was detected by green fluorescence emitted from the green fluorescent protein under a fluorescence microscope;B:expression of SHP－2 in cardiac fibroblasts.±sE.n=3.＊＊P＜0.01 vs control.圖3 重組腺病毒轉染心肌成纖維細胞及轉染后SHP－2的表達

4 SHP－2過表達增強AngⅡ作用下CFs的增殖

與對照組相比，沒有AngⅡ刺激、單純轉染組的CFs，即GFP組、WT組和EA組細胞增殖不明顯(P＞0.05);AngⅡ刺激后，其余各組增殖率明顯增高;AngⅡ組與對照組以及GFP+AngⅡ組與GFP組相比，細胞都有明顯增殖(P＜0.01);與轉染了空載體的GFP+AngⅡ組相比，轉染了SHP－2的WT+AngⅡ組和轉染了SHP－2－E76A突變體的EA+AngⅡ組增殖率分別是239% ±29%、279% ±12%，增殖率顯著增加，另外，EA+AngⅡ組增殖率也明顯高于WT+AngⅡ組(P ＜0.01)，見圖4。

Figure 4.SHP－2 overexpression enhanced cardiac fibroblast proliferation upon AngⅡtreatment.±sE.n=3.△△P＜0.01 vs group 1;▲▲P ＜0.01 vs group 2;*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs group 6;##P＜0.01 vs group 7.圖4 SHP－2過表達對心肌成纖維細胞活力的影響

5 SHP－2抑制劑NSC－87877降低AngⅡ作用下CFs的增殖

在AngⅡ作用下，當抑制劑濃度為25 μmol/L時抑制細胞增殖;在濃度達50 μmol/L時，增殖率為60% ±8%，明顯降低(P＜0.01);當抑制劑濃度增大到75 μmol/L時，對細胞的抑制增殖率為66% ±8%，與50 μmol/L的濃度相比沒有顯著差異，但與對照組相比，抑制效果依然明顯(P＜0.01)，見圖5。

Figure 5.SHP－2 inhibitor NSC－87877 attenuated cardiac fibroblast proliferation induced by AngⅡ.±sE.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group(NSC－87877=0 μmol/L).圖5 SHP－2抑制劑NSC－87877對細胞增殖的影響

討 論

心肌纖維化是惡化心力衰竭的一個過程。左室重構包括心肌重構和心肌間質(zhì)重構，心肌間質(zhì)重構的過程就是成纖維細胞過度增生和心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的過程［9］。AngⅡ是導致心肌成纖維細胞增殖，進而導致心臟間質(zhì)纖維化的主要體液因素。AngⅡ可顯著刺激CFs增加DNA合成速率，并可促進CFs早期反應基因的表達，加速其增殖［10－11］。為明確細胞內(nèi)參與細胞增殖的細胞信號轉導因子SHP－2的作用，我們檢測了SHP－2在 AngⅡ作用下對CFs的影響。

本實驗首先通過原代培養(yǎng)，建立CFs的培養(yǎng)體系，并鑒定成纖維細胞的純度達到90%以上，為后續(xù)實驗奠定基礎。有實驗表明AngⅡ有促成纖維細胞增殖、膠原合成增多等作用［12］。為明確AngⅡ作用的最佳濃度，本研究進行了濃度梯度實驗，確定了AngⅡ促增殖的最佳濃度為10－7mol/L。

我們采用重組腺病毒轉染方法過表達SHP－2，而后檢測SHP－2過表達對細胞增殖的影響。結果表明，SHP－2在AngⅡ作用下可明顯促進細胞增殖。而在無AngⅡ作用下的SHP－2過表達的WT組和EA組，對細胞增殖作用不明顯，這與SHP－2在基礎狀態(tài)下，N－SH2結構域與其酶解結構域相結合，而使其處于自我抑制狀態(tài)有關［13］。只有當其與磷酸化底物結合時，這種自我抑制狀態(tài)才能解除。有研究表明，AngⅡ可以增加AT1受體第319位點酪氨酸的磷酸化，進而激活AT1受體和EGFR之間的信號通路，文獻推測SHP－2可以與AT1受體的pTyr－319結合［14］。由此提示，SHP－2可能是 AngⅡ致CFs增殖的細胞內(nèi)關鍵因子。

我們又采用SHP－2抑制劑NSC－87877從反面測試我們的假設。結果顯示，SHP－2抑制劑的加入明顯抑制了AngⅡ刺激的CFs的增殖。雖然當NSC－87877濃度達到75 μmol/L時，這種抑制作用有所減低，但抑制效果依然顯著，抑制增殖率與50 μmol/L相比，沒有明顯差異。正如文獻報道，NSC－87877的最佳作用濃度為50 μmol/L，當濃度較高時，NSC－87877對SHP－1也有交叉抑制，即其抑制效應的特異性將降低［15］。

總之，我們的結果從一個側面提示了AngⅡ作用的細胞內(nèi)機制，但更深入的機制還有待探討。

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