唐 昱， 盛國太， 葛郁芝， 王云霞， 曹乾強， 周裔忠， 張繁之

(1江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，2江西省心血管病研究所，江西南昌330006)

肥厚心臟不僅表現(xiàn)在心臟結(jié)構(gòu)的改變，還可存在明顯的電生理特性改變，因此，探究心肌中其主導地位的鉀離子通道間的相互作用，在認識心肌細胞電生理和進行心律失常治療方面具有重大意義［1］。丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡA)是我國傳統(tǒng)中藥丹參的水溶性衍生物，具有抑制血小板黏附聚集、抗血栓形成、改善微循環(huán)、抗心肌缺血缺氧等功效，臨床上主要用于冠心病的治療，而有關(guān)抗心律失常作用的報道較少。本實驗通過采用全細胞膜片鉗技術(shù)，研究丹參酮ⅡA對肥厚心肌細胞快激活延遲整流鉀電流(the rapidly activating component of the delayed rectifier K+current，IKr)和慢激活延遲整流鉀電流(the slowly activating component of the delayed rectifier K+current，IKs)的影響，旨在從離子通道水平探討丹參酮ⅡA的抗心律失常作用機制，為肥厚心肌心律失常的防治提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物與試劑 60只健康雄性豚鼠，體質(zhì)量250～300 g(由南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)。丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(武漢生化藥業(yè)有限公司，批號為080520)，纈沙坦(北京諾華制藥有限公司)。

1.2 儀器 彩色多普勒超聲診斷儀(惠普公司);倒置顯微鏡(北京科樂公司);膜片鉗儀微電極(上海奧爾科特生物科技有限公司);電極拉制儀(華科大儀博生命科學儀器有限公司);Axopatch 200B膜片鉗放大器(Axon);DigiData 1200B型數(shù)/模(或模/數(shù))轉(zhuǎn)換器(Axon)。

1.3 溶液配制 (1)臺式液(mmol/L):NaCl 136、KCl 5.4、MgCl21.0、NaH2PO40.33、CaCl21.8、HEPES 10、glucose 10，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至7.4。配制時不加CaCl2即為無鈣臺氏液。(2)KB液(mmol/L):KCl 40、KH2PO425、MgSO43.0、KOH 80、L－谷氨酸 50.3、?；撬?20、HEPES 10、glucose 10、EGTA 0.5，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.4。記錄IKr時的細胞外液即為臺氏液。(3)記錄IKs時的細胞外液(mmol/L):NaCl 135、KCl 3.0、MgCl21.0、NaH2PO40.33、CaCl21.8、HEPES 10、glucose 10，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至7.4。(4)電極內(nèi)液(mmol/L):天門冬氨酸鉀120、KCl 20、HEPES 5、MgCl21.0、K2－ATP 4、EGTA 10、磷酸肌酸二鈉2.0，用KOH調(diào)pH到7.3。

2 方法

2.1 模型制作 分離腹主動脈和腎動脈后，在腎動脈上方約1 cm處的腹主動脈，用7號注射針頭緊貼腹主動脈，平行放置，結(jié)扎，抽出注射針頭逐層縫合肌肉及皮膚。其中12只行假手術(shù)，分離腹主動脈后不結(jié)扎。

2.2 血壓的測量 將實驗豚鼠裝入固定盒內(nèi)固定，尾部通過加壓套插入至接近尾根部，使鼠尾剛好處于脈搏傳感器的“脈搏信號傳感片”上方，調(diào)節(jié)鼠尾壓迫片使傳感片緊貼鼠尾下方的尾動脈，待脈搏穩(wěn)定后進行血壓測量。

2.3 實驗分組及給藥方式 12只行假手術(shù)的豚鼠為假手術(shù)組(A組)。48只成功建立心肌肥厚模型的豚鼠在術(shù)后4周隨機分為4組:未治療的肥厚模型組(B組)、低劑量丹參酮ⅡA組(10 mg·kg－1·d－1，C 組)、高劑量丹參酮ⅡA 組(20 mg·kg－1·d－1，D 組)和纈沙坦組(10 mg·kg－1·d－1，E 組)，每組各12只。給藥方式:采用腹腔注射，其中未治療的肥厚模型組和假手術(shù)組分別以等體積的蒸餾水腹腔注射。

2.4 心肌細胞分離 藥物干預(yù)8周后，開胸行在體主動脈插管，在通氧(95%O2，5%CO2)和保持37℃恒溫的條件下進行Langendorff灌流。用無鈣臺氏液［KCl 5.5、MgCl20.4、NaCl 140、NaH2PO40.33、HEPES 5、glucose 5.5(pH 7.4，NaOH)］逆行灌流3 ～5 min(壓力70 mmHg)，再用含0.4 g/L I型膠原酶、0.2 g/L蛋白酶 E、0.25 g/L小牛血清蛋白和80 μmol/L Ca2+的臺氏液循環(huán)灌流15 min后，然后用無鈣Tyrode液沖洗。剪去心房，用無酶的無鈣液終止酶解后取心室肌稱重，計算心室/體重比率(ventricle/weight ratio，VWR);再將心室肌在 KB液(KCl 40、KOH 70、KH2PO420、MgCl23、HEPES 10、EGTA 0.5、glucose 10、L－glumatic acid 50及 0.5%牛血清白蛋白)中室溫留置2 h備用。

2.5 膜片鉗全細胞記錄 選取紋理清晰、桿狀和大小適中的細胞在室溫下(22～25℃)應(yīng)用標準全細胞膜片鉗進行電生理數(shù)據(jù)收集。微電極經(jīng)垂直拉制儀拉制而成，充灌電極內(nèi)液后使電極阻抗保持在2～5 MΩ。采用微電極操縱器將電極緩慢推向細胞，同時給電極加約10 cmH2O正壓，當電極貼緊細胞膜后給電極加10～20 cmH2O負壓，吸引數(shù)秒鐘使電極尖端與細胞膜表面形成1 GΩ以上高阻封接，信號經(jīng)Ag/AgCl電極引導，由膜片鉗放大器放大。在電流穩(wěn)定后開始記錄實驗數(shù)據(jù)。記錄的電流值以電流密度(pA/pF)表示以消除細胞間誤差。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 各實驗組血壓測定

建立心肌肥厚模型組4周后測定血壓，本實驗發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組血壓(123±8)mmHg相比較，各手術(shù)模型組的血壓波動于(160±10)mmHg，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，各手術(shù)模型組間血壓無顯著差異(P ＞0.05)。

2 肥厚心肌病理生理改變

與A組相比，B、C、D和E組心室重量/體重比(ventricular weight/body weight，VW/BW)、左心室重量(left ventricular weight，LVM)和左室游離壁厚度(left ventricular free wall，LVFW)均升高(P ＜0.01);與B組相比，C、D和E組VW/BW、LVM和LVFW下降(P ＜0.01)，見表1。

3 各實驗組心肌細胞電生理變化

與A組相比，B組動作電位時程(action potential duration，APD)明顯延長;而 C、D、E組的心肌細胞APD較肥厚組明顯縮短(P＜0.01);與A組相比，B組膜電容(membrane capacitance，MC)增加;而與B組相比，C組、D和E組的心肌細胞MC降低(P＜0.01)，見表 2。

表1 各實驗組左心室重量、左室游離壁厚度和心室重量/體重的比較Table 1.The LVM，LVFW and VW/BW in each experimental group(±s.n=12)

表1 各實驗組左心室重量、左室游離壁厚度和心室重量/體重的比較Table 1.The LVM，LVFW and VW/BW in each experimental group(±s.n=12)

＊＊P＜0.01 vs group A;##P ＜0.01 vs group B.A:control;B:model;C:tanshinone ⅡA 10 mg·kg－1·d－1;D:tanshinoneⅡA 20 mg·kg－1·d－1;E:valsartan 10 mg·kg－1·d－1.

Group LVM(g) LVFW(mm)VM/BW(mg/g)A 3.9 ±0.1 4.8 ±0.1 3.0 ±0.3 B 8.1 ±0.2＊＊ 7.1 ±0.3＊＊ 4.8 ±0.2＊＊C 6.4 ±0.1## 5.6 ±0.6## 3.6 ±0.4##D 6.1 ±0.3## 5.5 ±0.4## 3.5 ±0.3##E 6.5 ±0.2## 5.8 ±0.4## 3.4 ±0.6##

表2 各實驗組的動作電位時間和膜電容變化Table 2.The action potential duration and membrane capacitance in each experimental group(±s.n=12)

表2 各實驗組的動作電位時間和膜電容變化Table 2.The action potential duration and membrane capacitance in each experimental group(±s.n=12)

##P ＜0.01 vs group A;△△P ＜0.01 vs group B.

Group APD25(ms) APD50(ms) APD75(ms) APD90(ms) MC(pF)A 6.2 ±0.1 15.8 ±2.4 20.4 ±4.6 38.6 ±2.9 246 ±17 B 16.9 ±1.8## 75.7 ±3.0## 90.3 ±10.5## 123.7 ±12.8## 391 ±14##C 9.2 ±0.4△△ 20.8 ±3.6△△ 43.2 ±3.7△△ 50.8 ±7.9△△ 279 ±10△△D 7.1 ±0.3△△ 17.6 ±2.5△△ 31.3 ±4.0△△ 40.6 ±4.2△△ 258 ±11△△E 9.4 ±0.3△△ 20.2 ±1.9△△ 40.1 ±5.8△△ 51.2 ±6.4△△ 280 ±16△△

4 IKr及其尾電流 IKr－tail的測定

為排除干擾電流的影響，細胞外液中加入5 μmol/L硝苯地平 (ICa－L，特異性阻斷劑)和 30 μmol/L二乙酰醇293B(IKs特異性阻斷劑)以阻斷Ica－L和 IKs。鉗制電位(holding potential，HP)為－50 mV，去極化至－10 mV，5 000 ms的去極化脈沖，分別記錄各實驗組的IKr及IKr－tail電流(n=5)。與A組相比較，B 組 IKr及 IKr－tail電流均增強，而 C、D 和 E 組IKr及 IKr－tail電流比 B 組顯著降低(P ＜0.05)，C、D、E組間無顯著差異(P＞0.05)，見圖1、表3。

5 IKs及其尾電流 IKs－tail的測定

細胞外液中加入 5 μmol/L 硝苯地平(ICa－L，特異性阻斷劑)和100 μmol/L多菲利特(IKr特異性阻斷劑)以阻斷ICa－L和IKr。從－40 mV去極化至 +80 mV，5 000 ms的去極化脈沖，分別記錄各實驗組的IKs及 IKs－tail電流(n=5)。與 A 組相比較，B 組 IKs及IKs－tail電流均增強，C、D 和 E 組心肌細胞 IKs及 IKs－tail比B組顯著降低(P＜0.05)，見圖2、表3。

討 論

Figure 1.The IKrchanges of cardiomyocytes in each experimental group.圖1 各實驗組IKr的變化

心肌肥厚是心肌細胞對各種內(nèi)在和外在刺激引起的負荷過重的一種適應(yīng)和代償性反應(yīng)。當負荷超過一定界限時，心臟結(jié)構(gòu)、功能和離子通道均可發(fā)生變化，不僅心肌細胞肥大和間質(zhì)成分發(fā)生改變，還可導致心肌細胞膜上多種跨離子電流的異常改變，其APD延長，誘發(fā)嚴重的心律失常和心源性猝死［2－3］。本研究通過結(jié)扎腹主動脈制作心肌肥厚模型，證實肥厚心肌LVM、LVFW和VM/BW升高，APD明顯延長，這與文獻報道一致［4］。

Figure 2.The IKschanges of cardiomyocytes in each experimental group.圖2 各實驗組IKs的變化

表3 各實驗組IKr、IKs及其尾電流的變化Table 3.The changes of IKr，IKs，IKr－tailand IKs－tail in each experimental group(pA/pF.±s.n=12)

表3 各實驗組IKr、IKs及其尾電流的變化Table 3.The changes of IKr，IKs，IKr－tailand IKs－tail in each experimental group(pA/pF.±s.n=12)

*P ＜0.05 vs group A;△P ＜0.05 vs group B.

Group IKr IKr－tail IKs I Ks－tail A 1.28 ±0.09 1.49 ±0.20 5.98 ±1.09 0.69 ±0.14 B 1.89 ±0.10* 2.14 ±0.16* 11.59 ±1.11* 1.13 ±0.13*C 1.45 ±0.12△ 1.71 ±0.19△ 7.85 ±1.05△ 0.88 ±0.13△D 1.39 ±0.11△ 1.67 ±0.14△ 7.76 ±1.04△ 0.81 ±0.12△E 1.46 ±0.13△ 1.73 ±0.20△ 7.87 ±1.08△ 0.90 ±0.16△

心肌細胞動作電位的形成是細胞膜上多種離子通道順序開關(guān)綜合作用的結(jié)果，任何離子通道電流的異常均可影響正常動作電位的形成，導致各種心律失常的發(fā)生［5］。IKr是鉀通道基因編碼的延遲整流鉀電流的快成分，開放時間非常短，而關(guān)閉的時間則相對較長，對調(diào)節(jié)心肌細胞動作電位2相平臺期的終止及3相復(fù)極化具有重要的意義［6］。IKs是動作電位復(fù)極的重要組成部分，其基因表達異?？墒沟猛庀驈?fù)極電流減少，細胞動作電位時程延長［7］。IKr和IKs對調(diào)節(jié)心肌細胞動作電位平臺期和復(fù)極化具有重要意義［8－9］。研究表明，病變心肌 IKr和 IKs明顯增強，可由折返機制形成快速性心律失常，易發(fā)生心室纖顫，增加心源性猝死的危險性。本實驗觀察到與假手術(shù)組相比較，肥厚心肌IKs和IKs及其尾電流均增大，具有致心律失常性離子通道病變的基礎(chǔ)［10］。

心肌鉀離子通道在電生理學研究方面取得了許多新進展，人們開始懷疑鉀離子通道能否成為抗心律失常藥物有益的作用靶點。于鋒等［11］采用L－甲狀腺素誘發(fā)豚鼠心肌病模型，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿明顯阻斷肥厚心肌細胞中異常增大的IKr和IKs，為藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了有利的依據(jù)。中醫(yī)藥學具有我國的傳統(tǒng)和特色，人們在長期的臨床實踐中，發(fā)現(xiàn)許多中藥具有抗心律失常及潛在的預(yù)防猝死作用。丹參酮IIA是中藥丹參的提取物，具有異搏停L型鈣通道阻斷作用，清除自由基，抗動脈粥樣硬化，降低心肌耗氧量，抑菌和抗腫瘤等作用［12］。王照華等［13］報道丹參酮能夠在抗心肌肥厚的同時通過減少ICa和恢復(fù)Ito鉀離子通道的活性，起到預(yù)防心律失常的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA和纈沙坦都能顯著縮短肥大心肌細胞動作電位時間的延長，抑制肥厚心肌細胞上增大的IKr和IKs電流密度。但不同劑量丹參酮之間無統(tǒng)計學意義，這可能與本實驗觀測的時點有關(guān)，具體還需要深入研究加以證實。心肌動作電位形成是多種離子通道共同參與的過程，決定復(fù)極過程的時程通道電流，主要有Ito、ICa、IKr和 IKs等。本實驗研究結(jié)果提示丹參酮對動作電位時程的影響，可能比較復(fù)雜，可能通過多通道阻斷整合發(fā)揮作用。研究表明血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑如纈沙坦等藥物可通過降低上游損失從而減輕與心肌重構(gòu)和跨膜信號轉(zhuǎn)導通路系統(tǒng)異常等相關(guān)的離子通道?。?4］。但是丹參酮ⅡA是否通過類似的機制的對肥厚心肌動作時程的整合作用，有待進一步研究。

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