宋歡歡， 徐尚華△， 黃茂芝， 許昌聲， 謝良地

(1福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建南平353000;2福建省高血壓研究所，福建福州350004)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種炎癥性、免疫性疾病。單核細(xì)胞趨化蛋白 1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP－1)可募集血液中的單核細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下，同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)膜炎性反應(yīng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化起始過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性心絞痛、血管痙攣、急性冠脈綜合癥病人血漿MCP－1表達(dá)增高;阻斷MCP－1可以阻止血管早期炎癥反應(yīng)[1－2]。在動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等心血管和代謝性疾病中，氧化應(yīng)激致細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)增高，參與血管炎癥過(guò)程[3－4]。研究發(fā)現(xiàn)，MCP－1的釋放加速動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生[5]。高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)是AS的一個(gè)新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究表明，AS患者血清Hcy水平明顯高于正常人，且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[6－7]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 δ(peroxisome proliferator activated receptor δ，PPARδ)是一類依賴配體激活的核激素受體，屬于類固醇受體超家族。PPARδ不但是脂肪酸代謝的一個(gè)重要調(diào)節(jié)者，而且研究發(fā)現(xiàn)其在炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化中也發(fā)揮重要作用[8－10]。本研究通過(guò)觀察 PPARδ 激活后對(duì)Hcy誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)表達(dá)MCP－1的影響并探討其機(jī)制。為動(dòng)脈粥樣硬化，尤其是伴有高同型半胱氨酸血癥的動(dòng)脈粥樣硬化等心血管和代謝紊亂疾病提供潛在的治療靶點(diǎn)。

材料和方法

1 主要試劑及儀器

M199細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、0.1%Ⅰ型膠原酶、0.25%胰酶－EDTA(Gibco);二氧化碳培養(yǎng)箱(Napco);倒置相差熒光顯微鏡(Olympus);Hcy、GW0742、DPI干粉(Sigma);RT－PCR試劑盒、Tag酶(Fermentas);Trizol試劑、瓊脂糖(Invitrogen);PPARδ抗體(Abcam);β－actin抗體(Santa Cruz);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(中杉金橋公司);vWF抗體(Dako);山羊抗兔IgG－R(Santa Cruz);活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司);硝酸纖維素膜(Millipore);紫外分光光度計(jì)(上海儀器廠);PCR擴(kuò)增儀(Bioneer);高速低溫離心機(jī)(Beckman);系列凝膠成像系統(tǒng)(Vilber Lourmat);水平瓊脂糖電泳槽、DYCZ－24DN型 雙垂直電泳儀、DYCP－40C型半干式碳板轉(zhuǎn)印儀和DYY－III－6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 細(xì)胞消化及培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，取健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)后新鮮的胎兒臍帶15～20 cm(標(biāo)本來(lái)自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)，低溫保存于M199培養(yǎng)基中，4 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞消化分離。采用膠原酶消化法分離HUVECs，于超凈臺(tái)內(nèi)在臍靜脈一端插入16號(hào)針頭并以止血鉗固定，用37℃預(yù)熱的PBS沖洗至無(wú)血跡，用另一把止血鉗夾住臍帶的另一端，注入預(yù)熱的0.1%Ⅰ型膠原酶10～15 mL至臍靜脈充盈飽滿，室溫消化15 min;用不含F(xiàn)BS的M199培養(yǎng)液沖洗1遍，將消化液收集入15 mL無(wú)菌離心管，1 500 r/min離心10 min;棄上清，用含20%FBS的M199完全培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2～3 d換液，用第2代或第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞鑒定 取1代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞鋪滿80%左右，PBS洗滌3次;用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次;在含0.5%Triton X －100的PBS中孵育20 min，PBS洗滌3次;1%BSA室溫封閉30 min，Ⅰ抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次;Ⅱ抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次;熒光顯微鏡下觀察。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 取2～3代細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞鋪滿80%左右，換用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、Hcy組、GW0742(PPARδ特異激動(dòng)劑)組和二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI，NAPDH 氧化酶特異抑制劑)組;先加入 GW0742(終濃度 10－6mol/L)、DPI(終濃度10－5mol/L)，30 min 后加入 Hcy(終濃度 10－3mol/L)作用24 h后處理細(xì)胞(每次實(shí)驗(yàn)每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次)。

2.4 RT－PCR檢測(cè)目的基因 采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)濃度后，按RT－PCR說(shuō)明書(shū)操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后加PCR Mix及相應(yīng)引物擴(kuò)增MCP－1、PPARδ及GAPDH。MCP－1上游引物5'－ATGAAAGTCTCTGCCGCC －3'，下游引物 5'－TTGCTTGTCCAGGTGGTC －3'，290 bp;PPARδ 上游引物 5'－ACGCTATCCGTTTGGTCG －3'，下游引物 5'－CTCACGGGTGACAAAGCC －3'，524 bp;內(nèi)參照(GAPDH)上游引物5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC － 3'，下游引物 5'－ TCCACCACCTGTTGCCTGTA －3'，454 bp。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min;PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析其吸光度值，目的基因和內(nèi)參照的吸光度比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 Western blotting檢測(cè) PPARδ蛋白表達(dá) 以預(yù)冷PBS洗滌干預(yù)細(xì)胞2次，添加了PMSF和蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液于冰上裂解細(xì)胞5 min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并收集至1.5 mL的離心管中，超聲振蕩，按上樣緩沖液和蛋白4∶1混合，100℃水浴5 min;12 000 r/min離心5 min，取上清－80℃冰箱保存。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;加入Ⅰ抗4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min;再加HRP標(biāo)記的Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min;發(fā)光劑ECL盒顯色反應(yīng)。用凝膠圖像分析所得電泳圖的平均吸光度值。

2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS初級(jí)熒光測(cè)定 用24孔培養(yǎng)板干預(yù)細(xì)胞，按 ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，取 130 μL Genmed染色液(Reagent B)至15 mL離心管，加入12.870 mL Genmed稀釋液(Reagent C)，混勻后，標(biāo)記為Genmed染色工作液，避光37℃保存;然后抽去24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，沿著孔壁各孔加入500 μL Genmed染色工作液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20 min;抽出Genmed染色工作液，沿著孔壁各加入500 μL 37℃預(yù)熱的 Genmed 保存液(Reagent D)，倒置熒光顯微鏡觀察，拍照。用Image－Pro Plus對(duì)熒光圖片進(jìn)行分析，計(jì)算吸光度，吸光度越高，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高。以空白對(duì)照組的吸光度為基準(zhǔn)值(100)，計(jì)算每組細(xì)胞的ROS相對(duì)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 HUVECs 鑒定

vWF因子免疫熒光發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)激發(fā)出紅色熒光，即呈陽(yáng)性反應(yīng)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Red fluorescence was observed in the cytoplasm of HUVECs under fluorescent microscope(×400).圖1 熒光顯微鏡下HUVECs細(xì)胞質(zhì)激發(fā)出紅色熒光

2 Hcy對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)的影響

Hcy(10－5～10－3mol/L)呈濃度依賴性促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞 MCP－1 mRNA表達(dá)，Hcy濃度為10－5mol/L時(shí)，與空白對(duì)照組相比，MCP－1 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Effect of Hcy on the mRNA expression of MCP－1 in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10 －6mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －5mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－4mol/L)group;Lane 5:Hcy(10－3mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group.圖2 Hcy對(duì)HUVECs MCP－1 mRNA表達(dá)的影響

3 Hcy對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ mRNA表達(dá)的影響

Hcy(10－5～10－3mol/L)呈濃度依賴性降低人內(nèi)皮細(xì)胞 PPARδ mRNA表達(dá)，Hcy濃度為 10－5mol/L時(shí)，與空白對(duì)照組相比，PPARδ mRNA表達(dá)顯著降低 (P＜0.01)，見(jiàn)圖3。

4 GW0742和DPI對(duì)Hcy誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MCP－1 mRNA的影響

與空白對(duì)照組相比，Hcy組人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01);與Hcy組相比，GW0742組和DPI組人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)都顯著降低(P＜0.01)，見(jiàn)圖4。

5 GW0742和DPI對(duì)Hcy誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PPARδ mRNA的影響

與空白對(duì)照組相比，Hcy組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與Hcy組相比，DPI組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;GW0742組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ mRNA顯著增高(P ＜0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 3.Effect of Hcy on the mRNA expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10 －6mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －5mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－4mol/L)group;Lane 5:Hcy(10－3mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group.圖3 Hcy對(duì)HUVECs PPARδ mRNA表達(dá)的影響

Figure 4.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced mRNA expression of MCP －1 in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10 －6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－3mol/L)+DPI(10－5mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group;##P＜0.01 vs Hcy group.圖4 GW0742和DPI對(duì)Hcy誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)MCP－1 mRNA的影響

6 GW0742和DPI對(duì)Hcy誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PPARδ蛋白的影響

與空白對(duì)照組相比，Hcy組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05);與Hcy組相比，DPI組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GW0742組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 5.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced mRNA expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10－3mol/L)+GW0742(10－6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10 －3mol/L)+DPI(10 －5mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖5 GW0742和 DPI對(duì) Hcy誘導(dǎo) HUVECs表達(dá)PPARδ mRNA的影響

Figure 6.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced protein expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10 －6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－3mol/L)+DPI(10－5mol/L)group.±s.n=5.*P＜0.05 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖6 GW0742和DPI對(duì)Hcy誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)PPARδ蛋白的影響

7 GW0742和DPI對(duì)Hcy誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響

與空白對(duì)照組相比，Hcy組人內(nèi)皮細(xì)胞ROS熒光信號(hào)增強(qiáng);與Hcy組相比，GW0742組和DPI組人內(nèi)皮細(xì)胞ROS熒光信號(hào)減弱，見(jiàn)圖7。

Figure 7.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced production of ROS in HUVECs(×400).Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10－6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10 －3mol/L)+DPI(10 －5mol/L)group.±s.n=5.*P＜0.05 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖7 GW0742和DPI對(duì)Hcy誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS的影響

討 論

血漿Hcy的增高和一些代謝紊亂疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化等密切相關(guān)。HHcy被認(rèn)為是AS的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。陶碩秋等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Hcy通過(guò)NADPH氧化酶介導(dǎo)ROS途徑，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子－1(vascular cell adhesion molecule－1，VCAM－1)而參與AS的發(fā)病過(guò)程。MCP－1募集的單核細(xì)胞參與AS的起始過(guò)程。研究指出，血液中MCP－1增高可增加冠心病人急性心梗和死亡發(fā)生率[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy呈濃度依賴性地促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)。Hwang等[13]在高蛋氨酸飼養(yǎng)大鼠發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟MCP－1表達(dá)增加，同時(shí)腎小球硬化增加。由此可見(jiàn)，Hcy引起的MCP－1表達(dá)增高在HHcy引起的AS過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，氧化應(yīng)激致細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)增高[3]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Hcy在促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)增高的同時(shí)還增加了細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放，而DPI抑制Hcy促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)ROS水平。我們的結(jié)果表明，ROS參與Hcy誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1表達(dá)的過(guò)程。

我們的研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，Hcy可抑制人內(nèi)皮細(xì)胞 PPARδ mRNA 和蛋白的表達(dá)。Lee 等[14－15]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠炎癥因子表達(dá)增高的同時(shí)，而PPARδ表達(dá)下降。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活后可以抑制Hcy誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA的表達(dá);Zingarelli等[16]在研究小鼠敗血癥模型時(shí)發(fā)現(xiàn)PPARδ表達(dá)減弱，而小鼠全身性炎癥因子的釋放增加，這種反應(yīng)在應(yīng)用PPARδ激動(dòng)劑時(shí)得到改善。楊大春等[17]在研究心肌梗死重構(gòu)大鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活后可以通過(guò)抑制炎癥因子基質(zhì)金屬蛋白酶－9表達(dá)，從而改善梗死心肌重塑。這表明PPARδ可以通過(guò)抑制炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活在抑制Hcy誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)的同時(shí)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，而應(yīng)用DPI也可抑制Hcy誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1mRNA的表達(dá)，提示PPARδ激活可能是通過(guò)ROS途徑抑制MCP－1的表達(dá)，從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。而 Fan等[18]研究表明，PPARδ可通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放抗氧化應(yīng)激機(jī)制抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)。但其具體作用機(jī)制仍需更深入的研究。

總之，我們發(fā)現(xiàn)，Hcy可以誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA的表達(dá)及ROS的產(chǎn)生，而PPARδ激活后抑制這些作用，其可能是通過(guò)NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS途徑發(fā)揮抗炎作用。PPARδ有望成為動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)。

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