譚 真，李 潔，黎明濤，劉 煒，于文娟#，夏婷婷

(中山大學(xué)1附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，2中山醫(yī)學(xué)院研究中心蛋白質(zhì)組學(xué)，廣東廣州510080)

“種植窗”時期子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能的及時轉(zhuǎn)換是胚胎著床與母胎界面形成的關(guān)鍵。長期以來，臨床工作中主要通過超聲測定內(nèi)膜厚度與形態(tài)以及血清激素水平評價子宮內(nèi)膜的功能狀態(tài)。然而血清雌、孕激素水平與子宮內(nèi)膜發(fā)育并不完全同步，內(nèi)膜的厚度與形態(tài)也不能準確說明其形態(tài)學(xué)改變。既往研究報道的子宮內(nèi)膜上皮細胞吞飲泡、整合素αVβ3、白血病抑制因子、血管內(nèi)皮生長因子的表達可以部分地反映子宮內(nèi)膜對胚胎的接受性[1－2]。但至今為止，還未能找到更完整的、能動態(tài)反映子宮內(nèi)膜對胚胎接受性變化的方法。

近年來基因芯片技術(shù)在人類子宮內(nèi)膜研究的結(jié)果表明:“種植窗”時期存在多個基因表達的上調(diào)和下調(diào)[3－5]。然而關(guān)于功能基因蛋白質(zhì)組群的表達和研究還未見報道。我們選擇正常生育能力婦女，采用熒光差異凝膠電泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D －DIGE)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix－assisted laser desorption/ionization time－of－flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS)為主的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、Western blotting技術(shù)鑒定和分析子宮內(nèi)膜組織蛋白質(zhì)表達的變化，并查找文獻進行差異表達蛋白質(zhì)功能的聚類分析，從整體水平、連續(xù)、動態(tài)地探討子宮內(nèi)膜對胚胎接受性轉(zhuǎn)化過程中的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料來源

2005年9月～2006年2月募集有正常生育能力的女性志愿者4名并簽署知情同意書，年齡分別為30、30、32、33歲。采用經(jīng)陰道超聲檢測卵泡發(fā)育結(jié)合血、尿黃體生成素(luteinizing hormone，LH)激素測定。以血清LH＞20 IU/L或基礎(chǔ)值4倍確定為LH峰值日。分別于同一婦女同一月經(jīng)周期“種植窗”前期(LH+2 d)和“種植窗”時期(LH+7 d)，采用Wallace endometrial sampler先后進行2次微創(chuàng)組織活檢，獲取子宮腔前、后壁內(nèi)膜組織約0.2～0.4 g作為自身對照實驗材料。一部分組織行HE染色進行組織形態(tài)學(xué)和雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)測定評估，根據(jù)Noveys標準確定組織學(xué)分期。另一部分組織經(jīng)裂解、勻漿、離心、純化、濃度測定后用于蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達和Western blotting半定量分析。

2 方法

2.1 2D－DIGE 熒光染料CyDyes標記樣品蛋白(熒光標記試劑盒，Amersham Biosciences)，進行一向等電聚焦電泳和二向十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳。激光掃描儀掃描成像，DeCyder軟件進行圖像分析，定量蛋白豐度差異，確定差異表達蛋白質(zhì)斑點。根據(jù)以下3個標準:(1)比較LH+2 d和LH+7 d蛋白斑點的差異，進行t－test，P＜0.05;(2)灰度差異＞1.40倍;(3)同一蛋白在12個蛋白表達譜中出現(xiàn)≥10次，選取斑點作為入選的差異斑點。進一步刪除三維圖中無凸起、脫尾、與局部未入選斑點比較變化趨勢相同的斑點后確認將進入質(zhì)譜分析的差異表達斑點，并在2張制備膠選中和標記相應(yīng)斑點，建立切點目錄。

2.2 質(zhì)譜分析 將切點目錄輸入全自動斑點處理工作站，進行斑點切割、沖洗、干燥、酶解消化、加入基質(zhì)和質(zhì)譜靶點樣等操作后，使用MALDI－TOFMS測定其在膠內(nèi)酶降解后的肽質(zhì)量指紋圖譜，并到本地和在線蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫驗證。

2.3 差異蛋白資料分析 登陸ExPASy網(wǎng)站尋找相關(guān)蛋白質(zhì)的資料，在PubMed查閱相關(guān)文獻進行蛋白質(zhì)功能聚類分析并探討其與胚胎著床關(guān)系。

2.4 Western blotting驗證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果 選擇annexin IV作為目的蛋白，參照Western blotting(Cell Signaling)說明書操作。Western blotting顯影結(jié)果掃描定量分析目的條帶積分吸光度值(A值)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 子宮內(nèi)膜組織時相和功能的確定

結(jié)果顯示，LH+2 d和LH+7 d子宮內(nèi)膜分別呈現(xiàn)分泌早期和中期組織學(xué)改變，ER和PR表達符合正常黃體期子宮內(nèi)膜組織的變化趨勢，提示子宮內(nèi)膜時相正常，見表1。

表1 LH+2 d和LH+7 d子宮內(nèi)膜形態(tài)和ER、PR檢測Table 1.The histological changes and expression of ER and PR in LH+2 d and LH+7 d(%.±s.n=4)

表1 LH+2 d和LH+7 d子宮內(nèi)膜形態(tài)和ER、PR檢測Table 1.The histological changes and expression of ER and PR in LH+2 d and LH+7 d(%.±s.n=4)

Phase Histological change ER PR Epithelia Stroma cells Epithelia Stroma cells LH+2 d Early secretory phase 92.5 ±2.9 52.5 ±26.3 88.8 ±6.3 70.0 ±21.6 LH+7 d Mid －secretory phase 50.0 ±21.6 37.5 ±18.9 37.5 ±32.0 62.5 ±15.0

2 2D－DIGE圖譜

每張2D－DIGE凝膠經(jīng)3種不同波長的激光掃描可得到3個分別由Cy2、Cy3和Cy5標記的不同蛋白質(zhì)樣品圖像及合并的膠內(nèi)差異圖像，見圖1，Decyder軟件分析檢測到(2 555±98)個蛋白質(zhì)斑點。

Figure 1.2D －DIGE images of endometrial proteins during the implantation window.Individual proteins of endometrial LH+2 d，LH+7 d samples and a pooled internal standard were labeled with CyDyes Cy3，Cy5 and Cy2，and were mixed and separated on a 2D gel using 24 cm pH 3～10 NL strips in the first dimension and 10%SDS－PAGE gels in the second dimension.Gels were scanned to obtain single images of the internal standard(Cy2，red)(A)，LH+2 d proteins(Cy3，green)(B)and LH+7 d proteins(Cy5，blue)(C).An overlay of the three dyes(Cy2，Cy3，Cy5)(D)is shown.圖1 “種植窗”時期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)的2D－DIGE凝膠圖像

3 MALDI－TOF－MS鑒定

根據(jù)實驗方法中判斷差異表達斑點的3個篩選標準獲得入選斑點167個，確認差異表達斑點81個進入MALDI－TOF－MS PMF法鑒定，并通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)和Swissprot在線檢索鑒定，查找和確認差異表達蛋白質(zhì)共31個，其中17個上調(diào)表達，14個下調(diào)表達。

圖2～5顯示在2D－DIGE圖譜編號為2 033、pI約5.8、分子量約36的差異蛋白斑點的2D－DIGE斑點圖、三維圖、MS鑒定圖和Swissport在線檢索結(jié)果。該斑點經(jīng)鑒定為annexin IV，LH+7 d蛋白質(zhì)表達量為LH+2 d的2.12倍。

Figure 2.Three－dimensional view and spot map of annexin IV.圖2 AnnexinⅣ在LH+2 d和LH+7 d的差異表達圖

Figure 3.Graph view of annexin IV.圖3 AnnexinⅣ在LH+2 d/+7 d的差異表達圖

Figure 4.Mass spectral identification of annexin IV.圖4 AnnexinⅣ的質(zhì)譜鑒定

Figure 5.The searching result of peptide mapping fingerprint by Swissprot database was annexinⅣ.圖5 肽指紋圖譜經(jīng)Swissprot數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果為AnnexinⅣ

4 差異蛋白資料分析

登陸ExPASy網(wǎng)站尋找相關(guān)蛋白質(zhì)的資料，在PubMed查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)上述31個差異表達的蛋白質(zhì)功能涉及到細胞遷移與融合、酶活性改變、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控、血管生成和凝血纖溶等6大功能組，見表2。

5 Western blotting測定annexin IV差異表達

圖6結(jié)果表明annexin IV在LH+2 d和LH+7 d A值分別為46.249±32.376和249.507±31.959，P＜0.01，提示LH+7 d子宮內(nèi)膜組織annexin IV表達量較LH+2 d顯著增加。Western blotting結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)分析annexin IV表達趨勢一致，證實蛋白質(zhì)組學(xué)方法的準確性。

表2 31個“種植窗”時期人類子宮內(nèi)膜組織差異表達的蛋白質(zhì)Table 2.31 differentially expressed proteins identified in endowing the endometrium with receptivity

討 論

人類胚胎種植的低效率至今依然是生殖生物學(xué)領(lǐng)域中最大的挑戰(zhàn)。文獻報道這種低種植率現(xiàn)象與子宮內(nèi)膜－胚胎發(fā)育不同步，臨床缺乏預(yù)測與評估胚胎發(fā)育潛能和子宮內(nèi)膜對胚胎接受性的客觀方法密切相關(guān)。由于人類子宮內(nèi)膜對胚胎接受性存在時、空的短暫性，即胚胎著床活動受到“種植窗”時期的限制，“種植窗”的啟動常常發(fā)生在內(nèi)源性LH峰第4 ～5d，關(guān)閉發(fā)生在第9 ～10d[5]。因此探討在“種植窗”時期子宮內(nèi)膜組織的分子生物學(xué)變化及其機制是一個亟待解決的重要課題。

Figure 6.Annexin IV and β －actin levels were determined by Western blotting in LH+2 d(group A，A1－A4)and LH+7 d(group B，B1－B4)tissues.圖6 Western blotting檢測LH+2 d和LH+7 d annexin IV表達和目的條帶積分吸光度值

子宮內(nèi)膜是一種形態(tài)、功能都高度依賴激素調(diào)節(jié)的組織，增殖期子宮內(nèi)膜向接受態(tài)的轉(zhuǎn)化嚴格受到雌、孕激素和目前還未知因素的調(diào)控。排卵后子宮內(nèi)膜及時向接受態(tài)轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)組織重建、細胞按一定的時、空順序分泌相關(guān)蛋白或/和局部因子，以期識別胚胎形成具有接受胚胎著床能力的子宮內(nèi)膜。既往的研究由于被研究因子的獨立與局限、研究方法缺乏時、空連續(xù)性以及多因子表達的同期比較，其結(jié)果不足以真實地反映代表圍“種植窗”時期子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能轉(zhuǎn)化過程中局部因子的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系和調(diào)節(jié)機制。近年來基因芯片技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用結(jié)果已經(jīng)證實“種植窗”時期出現(xiàn)了數(shù)十個與胚胎著床相關(guān)基因的上調(diào)或下調(diào)表達，并對小部分特異基因進行了篩選、分析和克隆研究[3－5]。但是基因表達的結(jié)果并不能完全預(yù)測蛋白質(zhì)的表達、修飾與功能變化。而子宮內(nèi)膜對胚胎接受性的功能改變是一個多基因、多步驟和多階段的過程，由不同功能的蛋白質(zhì)在時間與空間上有序協(xié)同作用的結(jié)果。因此我們選用了能夠描述基因調(diào)節(jié)，對基因表達的蛋白質(zhì)水平進行相對定量測定的、反映蛋白質(zhì)組分整體變化的蛋白質(zhì)組學(xué)方法進行研究。

對復(fù)雜組織表達的多種蛋白質(zhì)進行研究面臨的主要問題是生物學(xué)變異，包括個體差異和組織時相的差異。我們選擇正常生育能力的婦女，于同一月經(jīng)周期LH+2 d和LH+7 d子宮內(nèi)膜取材，挑選組織時相符合分泌早期和分泌中期配對的子宮內(nèi)膜，從而減少了由于個體和組織時相差異導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。“種植窗”時期子宮內(nèi)膜處于高度血管化狀態(tài)，單純使用PBS沖洗不能有效去除血清蛋白，可能導(dǎo)致膠內(nèi)特定區(qū)域分辨率下降，掩蓋非血清蛋白。本研究選擇Berendt等[6]報道的飽和蔗糖緩沖液(含104IU/L肝素)方法沖洗子宮內(nèi)膜組織10 min，大幅降低血清蛋白，實驗結(jié)果顯示蛋白質(zhì)圖譜未見明顯的血清蛋白點，進一步證實該方法的可行性。

本研究采用2D－DIGE是雙向電泳的重要創(chuàng)新，該方法使用熒光標記物預(yù)先標記蛋白樣品，采用多重分析方式，利用所有樣本中的蛋白質(zhì)斑點同內(nèi)標比較分析其差異值，能夠消除凝膠之間的偏差，減少實驗誤差，保證所檢測到蛋白豐度變化的精確度，且熒光檢測靈敏度高，檢測范圍廣，與傳統(tǒng)的雙向電泳相比有重復(fù)性好，準確性高、標準化和高效的優(yōu)點[7]。從2D－DIGE圖譜中可見(2 555±98)個蛋白質(zhì)斑點，該結(jié)果靈敏度與Marouga等[8]報道結(jié)果類似。參考本校蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)標準，采用2DDIGE方法可檢測到差異大于10%的蛋白質(zhì)，為提高分辨率我們以差異＞1.4倍作為標準，選擇在12個蛋白表達譜中表達≥10次(P＜0.05)的斑點167個，確認差異表達斑點81個進行質(zhì)譜鑒定。并通過NCBI和Swissprot在線檢索，查找和確認差異表達蛋白質(zhì)共31個。Berendt等[6]報道pH 4～7和pH 7～9 IPG膠條進行同一小牛子宮內(nèi)膜樣本IEF，分別獲得1180和350個蛋白斑點，提示本研究使用寬范圍的IPG膠條(pH 3～10)進行IEF。觀察2D－DIGE圖譜可見堿性端蛋白斑點密集，提示擴大等電點范圍電泳將有利于獲得更多的蛋白質(zhì)斑點，針對該問題，今后研究可采用分離堿性蛋白質(zhì)的IPG膠條(pH 6～11，8～11，9～12)以擴大獲得的差異蛋白質(zhì)數(shù)量。

本研究獲得“種植窗”時期正常生育能力婦女子宮內(nèi)膜組織差異表達蛋白質(zhì)31個，包括膜蛋白、蛋白酶和肽、鈣離子結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、細胞黏附分子等，其中17個表達上調(diào)，14個表達下調(diào)。首次報道21個“種植窗”時期子宮內(nèi)膜組織差異表達蛋白質(zhì)，其中10個表達上調(diào)，11個表達下調(diào)。其中21個差異表達蛋白質(zhì)與人類子宮內(nèi)膜對胚胎接受性的關(guān)系還未見文獻報道。通過文獻查找發(fā)現(xiàn)31個差異表達的蛋白質(zhì)功能涉及到細胞遷移與融合、酶活性改變、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控、血管生成和凝血纖溶等6大功能組，這些蛋白質(zhì)功能與胚胎種植過程中所涉及的多種生物學(xué)活動相一致。值得注意的是與以往基因水平研究發(fā)現(xiàn)的基因表達存在較大差異[4－5]。這種現(xiàn)象是否與本研究使用的IPG膠條(pH 3～10)測定到的蛋白質(zhì)有限或與從基因到蛋白質(zhì)水平表達存在時空差異有關(guān)還需進一步實驗證實。

Annexin IV屬于annexin家族，是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有促進膜融合，參與囊胞運輸、鈣離子通道形成、細胞骨架活動、磷脂化與膜受體的功能調(diào)節(jié)以及胞吞、胞吐和分泌等重要生物功能[9]。近年對annexin IV在腫瘤細胞擴散過程中的研究提示其可能參與生長、分化和細胞形態(tài)轉(zhuǎn)換過程[10]。而胚胎種植過程中子宮內(nèi)膜從非接受態(tài)向接受態(tài)轉(zhuǎn)化過程中涉及上述類似的生物學(xué)過程。Riesewijk等[4]采用基因芯片技術(shù)比較LH+2 d/+7 d人類子宮內(nèi)膜annexin IV基因表達發(fā)現(xiàn)在“種植窗”期上調(diào)4倍。本研究蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示annexin IV表達增強2.12倍;Western blotting結(jié)果顯annexin IV表達趨勢與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，提示子宮內(nèi)膜向接受態(tài)轉(zhuǎn)化過程中存在annexin IV表達量的顯著增加。此結(jié)果與Ponnampalam等[11]報道結(jié)果一致。同時驗證了我們建立的微創(chuàng)子宮內(nèi)膜組織活檢取材方法聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)研究體系的準確性和可靠性。

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