孫宏偉，元 野，楊曉敏，孫劍萍*

1.牡丹江煙草科學研究所，黑龍江省牡丹江市西地明街63號 157011

2.東北農(nóng)業(yè)大學，哈爾濱市香坊區(qū)木材街59號 150030

由Pseudomonas syringae pv.tabai引起的煙草野火病是煙草上的主要葉部細菌病害，該病最早發(fā)現(xiàn)于美國的弗吉尼亞和北卡羅萊納州，現(xiàn)已廣泛分布于26個產(chǎn)煙國家和地區(qū)，造成了較嚴重的經(jīng)濟損失。目前該病主要用農(nóng)用鏈霉素進行防治，品種較為單一，且經(jīng)過連續(xù)多年的應用，病菌已產(chǎn)生抗藥性。為經(jīng)濟有效地控制該病的發(fā)生與危害，對煙草內(nèi)生拮抗野火病細菌進行篩選，既可以抑制病害，保護煙株，又可以防止由于化學農(nóng)藥的長期大量使用產(chǎn)生的“3R”問題，起到防病增產(chǎn)的效果［1-5］。為此，從煙草葉片中篩選出對煙草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）有顯著抑制作用的拮抗菌株，通過16S rDNA確定拮抗菌的分類地位，測定其對煙草葉片內(nèi)主要防御酶活性的影響，并對煙草成苗期野火病進行防治效果測定，旨在為新型生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種為龍江911。供試病原菌為煙草野火病菌Pseudomonas syringae pv.Tabai，由本所分離、鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

試驗于2009年至2010年進行，地點設在牡丹江煙草科學研究所試驗場（寧安市范家鄉(xiāng)）煙田。試驗育苗在大棚內(nèi)進行，托盤育苗，塑料盤規(guī)格：45 cm×65 cm（120孔）營養(yǎng)土為山皮土、砂子、腐熟豬糞以1∶1∶1配比，高溫熏蒸滅菌。大田試驗煙苗5月10日移栽，按當?shù)厣a(chǎn)技術(shù)規(guī)范進行田間管理。

1.2 煙草植株的采集及葉片中細菌的分離

用滅菌打孔器（直徑1 cm）從煙田采集旺長期健康煙株的煙葉葉圓片，稱取2 g放置于滅菌研缽中加1 mL無菌水研磨成勻漿，將勻漿10倍系列稀釋至10-6倍，將10-4至10-5稀釋液各取100 μL涂于NA平板上，每濃度設3次重復，28℃培養(yǎng)2～3 d。挑取不同類型的菌落，稀釋后在NA平板上劃線純化培養(yǎng)后，挑取劃線培養(yǎng)的單個菌落移入PDA斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 煙草野火病菌拮抗細菌的篩選［2,4,6-7］

菌株的活化及培養(yǎng)：將純培養(yǎng)的病原菌和待測細菌培養(yǎng)物置于NA液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)48 h后，配制成濃度為3×108cfu/mL的菌懸液備用。將5 mL病原菌懸液混勻在NA固體培養(yǎng)基中倒為平板。用移液槍吸取70 μL待測細菌菌懸液在平板上劃線，28℃培養(yǎng)48～72 h后觀察抑菌效果，并測量抑菌帶寬度。以未接菌的等量NA培養(yǎng)液代替待測細菌菌懸液為空白對照，重復3次。

1.4 煙草野火病拮抗細菌的鑒定

1.4.1 煙草野火病拮抗細菌純培養(yǎng)物總DNA的提取及檢測

將供試拮抗菌株接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至菌液濃度為1.8×108cfu/mL時（約24 h），取1 mL菌液加入到1.5 mL離心管中，7500 r/min離心5 min，棄上清液，然后按照薩姆布魯格的方法[8]提取煙草野火病拮抗細菌純培養(yǎng)物總DNA。

取DNA樣品4 μL在1%瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色，BIO-RAD凝膠影像分析系統(tǒng)（Bio-rad Quantity One 4.1.0）觀察并拍照。

1.4.2 細菌16S rDNA的PCR擴增

采用細菌16S rDNA V3區(qū)通用引物F338GC（5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′）和 R518（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′）進 行 PCR 擴 增 。

反應總體積50 μL的PCR擴增體系為：dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，10×buffer（含 MgCl2）5 μL，引物 F338GC（25 μmol/L）1μL，引 物 R518（25 μmol/L）1 μL，Taq 酶1 μL，模板 2 μL，無菌去離子水 39.5 μL。

PCR擴增條件為：94℃ 預變性5 min；94℃變性10 s，52 ℃退火 20 s，68 ℃延伸 40 s，35個循環(huán)；最后68℃下延伸7 min。

1.4.3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測及比對

將5 μL擴增產(chǎn)物置于混有EB的1%瓊脂糖凝膠上，在120 V電壓下電泳1 h，BIO-RAD凝膠影像分析系統(tǒng)（Bio-rad Quantity One 4.1.0）觀察并拍照。

將PCR產(chǎn)物由上海生工生物有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的序列進行同源性比對。

1.5 拮抗菌處理的煙草葉片主要防御酶活性測定

試驗設置拮抗菌誘導、煙草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabai）接種、拮抗菌誘導后接種煙草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabai）及清水對照4個處理，3次重復。在煙苗6～8葉期進行誘導，誘導后2 d葉面噴霧接種病原菌，誘導后 1，3，5，7，9，11，13和15 d分別取樣，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

取各處理的煙草葉片0.5 g，液氮研磨后，加入10 mL預冷的0.1 mol/L硼酸緩沖液［pH 8.8，含1 mmol/L EDTA、5 mmol/L巰基乙醇、1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、1%甘油］混勻，在冷凍離心機中4℃，10000 r/min離心25 min，吸取上清液即為酶粗提液，加緩沖液定容至10 mL。將酶粗提液分裝于Eppendorff管中，于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

參照Mozzetti等［9］的方法，在試管中加入0.1 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.8）4 mL，0.02 mmol/L L-苯丙氨酸 2 mL，酶粗提液 200 μL，對照用 200 μL 緩沖液代替酶液，30℃溫浴30 min，290 nm下比色，以每分鐘引起吸光度值變化0.01所需的酶量（U1）為1個酶活性單位，取3次重復的平均值。計算公式：

式中：N——酶粗提液總體積（mL）；W——樣品鮮重（g）；T——反應時間（min）；n——反應液所用酶粗提液的體積（mL）；d——比色杯直徑（cm），下同。

1.5.2 過氧化物酶（POD）活性

取各處理煙草葉片0.5 g，經(jīng)液氮研磨后，加入5 mL預冷的0.5 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.0含1%PVP），在冷凍離心機中4℃，10000 r/min離心20 min，吸取上清液，即為酶粗提液，以下實驗操作同PAL活性的測定方法。

參考 Hammerschmidt等［10］的方法，在試管中加入酶粗提液200 μL，5 mL 10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.0），0.25%愈創(chuàng)木酚0.2 mL，100 mmol/L H2O20.2 mL，470 nm下比色，以每分鐘引起吸光度值變化所需的酶量（U2）為1個酶活性單位，取3次重復的平均值。計算公式：

1.5.3 多酚氧化酶（PPO）活性

取各處理煙草葉片0.5 g，用液氮研磨后，加入5 ml預冷的0.2 mmol/L磷酸緩沖液［pH 6.0含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）］，繼續(xù)研磨成勻漿，樣品在冷凍離心機中4℃，15000 r/min離心20 min，收集上清液即為酶粗提液，以下實驗操作同PAL活性的測定方法。

參考Hammerschmidt等［10］的方法，在試管中加入6 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.0），200 μL酶粗提液，對照用200 μL緩沖液代替酶液，混勻后于30℃水浴中保溫10 min，然后加入2 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚，立即計時，398 nm下比色，以每分鐘引起吸光度變化所需的酶量（U3）為酶活性單位，取3次重復的平均值。計算公式：

1.6 煙草野火病拮抗菌防治效果

1.6.1 先處理后接病原菌的防治效果

煙草野火病菌液的制配：挑取致病力強的煙草野火病菌放入裝有500 mL NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28℃振蕩培養(yǎng)48 h，配制成濃度為3×108cfu/mL的菌懸液備用。

拮抗菌液的制配：挑取抑菌效果最好的菌株放入裝有500 mL NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28℃振蕩培養(yǎng)48 h，配制成濃度為3×108cfu/mL的菌懸液。

試驗設2個處理，1個空白對照，3次重復，9個小區(qū)，每小區(qū)100株成苗期煙株。處理A：農(nóng)用鏈霉素，稀釋5000倍，間隔24 h噴霧2次；處理B：拮抗菌液噴霧，間隔24 h噴霧2次；處理C（空白對照）：清水噴霧，間隔24 h，噴霧2次。在處理后24 h噴霧接種煙草野火病菌液。

接種7 d后調(diào)查各小區(qū)的病葉率。

1.6.2 先接病原菌后實施處理的防治效果

試驗設2個處理，1個空白對照，4次重復，9個小區(qū)，每小區(qū)100株成苗期煙株。在各小區(qū)噴霧接種1.6.1節(jié)中配制的煙草野火病菌液24 h后，再對各小區(qū)進行處理。處理A：農(nóng)用鏈霉素，稀釋5000倍噴霧，間隔24 h噴霧2次；處理B：已配制的拮抗菌液噴霧，間隔24 h噴霧2次；處理C（空白對照）：清水噴霧，間隔24 h噴霧2次。處理時及處理后7 d分別調(diào)查各小區(qū)的病葉率。

1.6.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel進行方差分析，用Duncan新復極差法進行多重比較檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草野火病菌拮抗細菌的篩選

從煙草葉片中共分離到287個細菌分離物，其中14個株對煙草野火病菌有一定的拮抗作用，其中抑菌效果最好的菌株為Y32，見圖1和圖2，其抑菌帶寬度為9.3 mm。

圖1 菌株Y32對煙草野火病菌的拮抗效果

2.2 煙草野火病菌拮抗細菌總DNA的提取

總DNA的提取結(jié)果如圖3所示。所得DNA條帶片段集中，且無雜帶，提取效果好，可進行下一步的PCR鑒定。

圖3 拮抗細菌Y32純培養(yǎng)物總DNA

2.3 煙草野火病菌拮抗細菌16S rDNA的檢測及比對

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖4所示，擴增片段即是目的片段，250 bp左右。比對結(jié)果表明Y32與枯草芽孢桿菌MSB10的同源性為96%，證明該菌屬于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

圖4 拮抗細菌Y32 16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.4 拮抗菌液對煙草葉片主要防御酶活性的影響［3］

2.4.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性

煙草植株經(jīng)拮抗菌液誘導、接種處理后苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，各處理PAL活性均高于對照，其中誘導后接種處理在處理 9 d 時產(chǎn)生活性高峰，其峰值達 60.60 U1·g-1·cm-1，之后雖有所下降，但始終高于其他處理；誘導處理亦在9 d時產(chǎn)生活性高峰，峰值接近于誘導后接種處理，11 d后變化平穩(wěn)；接種處理雖在處理7 d時產(chǎn)生活性高峰，但比誘導和誘導后接種的處理酶活性低。說明拮抗Y32菌液有提高煙草PAL活性的作用。

圖5 拮抗菌液誘導對煙草葉片中PAL活性的影響

2.4.2 過氧化物酶（POD）的活性

煙草植株經(jīng)拮抗菌液誘導、接種處理后過氧化物酶（POD）活性測定結(jié)果見圖6。從圖6中可以看出，各處理POD的活性均明顯高于對照，經(jīng)誘導后接種的處理在7 d時出現(xiàn)酶活峰值，雖在9 d時有所下降，但始終維持在一個較高的水平；接種處理的POD活性雖在3 d時迅速上升，但隨后5～15 d中的變化較緩慢，且始終低于誘導后接種處理?？沙醪秸J為在病原菌侵入前進行拮抗菌液誘導可顯著提高煙草POD活性，增強煙草對病原菌的抗性。

圖6 拮抗菌液誘導對煙草葉片中POD活性的影響

2.4.3 多酚氧化酶（PPO）的活性

圖7 拮抗菌液誘導對煙草葉片中PPO活性的影響

煙草植株經(jīng)拮抗菌液誘導、接種處理后多酚氧化酶（PPO）活性測定結(jié)果見圖7。從圖7中可以看出，各處理PPO活性均高于對照。誘導后接種的處理在第3，9，13天時分別出現(xiàn)酶活性高峰，且自始至終高于其他處理；誘導、接種和對照處理的差距不大；各處理中，誘導和誘導后接種處理的酶活性變化相對較為平緩，接種處理酶活性產(chǎn)生波動，可見，誘導后接種可以保持較高水平且相對穩(wěn)定的PPO活性，可以初步說明該菌液能夠誘導提高煙草中PPO活性。

2.5 拮抗菌對煙草野火病的防效影響

2.5.1 先處理后接病原菌的防效

連續(xù)實施2次A，B，C處理后，間隔24 h噴霧接種野火病菌，結(jié)果見表1。表1結(jié)果表明野火病拮抗菌株Y32對成苗期煙草野火病的防治效果達97.54%，農(nóng)用鏈霉素防治效果為41.44%，說明拮抗菌株Y32的防治效果顯著高于農(nóng)用鏈霉素的防治效果。

表1 野火病拮抗菌株Y32對成苗期煙草野火病預防效果①（%）

注：①5月15日寧安范家鄉(xiāng)調(diào)查,下同。

2.5.2 先接病原菌后實施處理的防效

接種野火病菌1 d后連續(xù)2次間隔1 d實施A,B,C 3個處理。試驗結(jié)果見表2。調(diào)查結(jié)果顯示野火病拮抗菌株Y32對成苗期煙草野火病的防治效果達51.40%，農(nóng)用鏈霉素防治效果為50.69%，說明拮抗菌株Y32的防治效果稍高于農(nóng)用鏈霉素的防治效果。

表2 野火病拮抗菌株Y32對成苗期煙草野火病治療效果（%）

3 結(jié)論

（1）從煙草葉片中分離出的對煙草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.Tabai）有顯著抑制作用的細菌14株，其拮抗效果最好的菌株為Y32，抑菌帶寬度為9.3 mm，經(jīng)16S rDNA序列鑒定該菌屬于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

（2）煙草植株經(jīng)Y32拮抗菌液誘導后接種，葉片內(nèi)主要防御酶PAL，POD，PPO活性均顯著增強，證明煙株噴施Y32菌株后能增強抗煙草野火病的能力。

（3）野火病拮抗菌株Y32對煙草野火病具有較好的防治效果，對成苗期煙草野火病的防治效果為97.54%，而農(nóng)用鏈霉素防治效果為41.44%，且后接病菌的處理防治效果顯著高于先接病菌的處理，說明該菌珠對煙草野火病的預防作用較強。

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