郝 喆，潘珊珊

運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)晚期保護(hù)效應(yīng)中大鼠心肌組織εPKC的表達(dá)變化

郝 喆，潘珊珊

目的：探討運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)（EP）對(duì)力竭所致心肌損傷的晚期保護(hù)效應(yīng)中心肌εPKC表達(dá)變化。方法：SD大鼠分為對(duì)照組（C組）、力竭運(yùn)動(dòng)組（EE組）、晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組（LEP組）、晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)＋力竭運(yùn)動(dòng)組（LEP＋EE組）。在EP模型基礎(chǔ)上，用力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)致大鼠心肌損傷。用免疫化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清cTnI的含量；用免疫印跡法與免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌εPKC定量與定位表達(dá)變化。結(jié)果：與C組比，EE組血清cTnI水平、εPKC蛋白水平顯著升高，免疫反應(yīng)陽性于心肌閏盤聚集；LEP組血清cTnI無明顯變化，εPKC蛋白水平顯著升高，免疫反應(yīng)陽性于心肌閏盤聚集。與EE組比，LEP＋EE組血清cTnI水平顯著下降，蛋白水平無明顯變化，免疫反應(yīng)陽性未在心肌閏盤聚集。結(jié)論：εPKC參與了EP對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)致心肌損傷的晚期保護(hù)效應(yīng)。

εPKC；運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)；晚期心肌保護(hù)效應(yīng)；力竭運(yùn)動(dòng)；心肌損傷；鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

心肌缺血再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）是引發(fā)心肌損傷的主要原因之一，缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IP）［20］可減輕心肌I／R損傷的報(bào)道已屢見不鮮。近年，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界研究者發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的保護(hù)效應(yīng)，在一定程度上減輕心肌I／R損傷，這種一次短時(shí)間大強(qiáng)度的間歇運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)的現(xiàn)象稱為運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)（exercise preconditioning，EP）［1，4，5，11，25，32，33］。EP的保護(hù)效應(yīng)分為早期和晚期［5，11］，由于EP晚期保護(hù)效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間較長，在心肌保護(hù)方面的應(yīng)用價(jià)值而備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前，EP晚期保護(hù)效應(yīng)已被許多研究證實(shí)，但EP對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)致急性心肌損傷晚期保護(hù)效應(yīng)期的研究鮮有報(bào)道。而有關(guān)EP誘導(dǎo)心肌產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制目前尚未闡明，有研究表明，EP誘導(dǎo)心肌保護(hù)效應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能與IP類似，分為觸發(fā)物質(zhì)、中介物質(zhì)、效應(yīng)物質(zhì)3個(gè)環(huán)節(jié)［2，3］。在對(duì)IP機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，PKC作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的中介物質(zhì)，在IP中調(diào)控了下游的眾多的效應(yīng)蛋白，改變ATP敏感鉀離子通道的活性［3，10］及相關(guān)蛋白酶活性，誘導(dǎo)應(yīng)激蛋白生成，發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)效應(yīng)［15］。迄今，已發(fā)現(xiàn)的PKC亞型至少有13種，但PKC各亞型的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑各不相同。PKC亞型εPKC作為介導(dǎo)IP晚期心肌保護(hù)效應(yīng)的關(guān)鍵中介物質(zhì)［16］，在EP誘導(dǎo)的減輕力竭運(yùn)動(dòng)致急性心肌損傷的晚期保護(hù)效應(yīng)中的表達(dá)變化如何？尚待進(jìn)一步探討。因此，本實(shí)驗(yàn)在EP動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，用力竭運(yùn)動(dòng)致大鼠急性心肌損傷，采用血清cTnI的檢測(cè)評(píng)價(jià)EP晚期效應(yīng)期對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)致急性心肌損傷的保護(hù)效應(yīng)；同時(shí)，采用免疫印跡法與免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌εPKC的蛋白水平，重點(diǎn)觀察εPKC在EP晚期保護(hù)效應(yīng)中的變化，探討心肌εPKC參與介導(dǎo)EP晚期保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制，為EP心肌保護(hù)效應(yīng)與機(jī)制的研究提供新的實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠100只，體重256±13g（購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，5只／籠，均以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)（購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），自由飲食。室溫20℃～22℃，相對(duì)濕度45%～50%。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，期間進(jìn)行3天速度15m／min、時(shí)間10min，坡度為0°的跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，用以篩除不能適應(yīng)跑臺(tái)的大鼠。將剩余大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control group，C組）、力竭運(yùn)動(dòng)組（exhaustive exercise group，EE組）、晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組（late exercise preconditioning group，LEP組）、晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)＋力竭運(yùn)動(dòng)組（late exercise preconditioning＋exhaustive exercise group，LEP＋EE組）。

1.2 EP模型的建立

本實(shí)驗(yàn)參考本課題組以往的實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案［1－5，32］建立EP動(dòng)物模型。LEP組大鼠進(jìn)行一次速度為30m／min（相當(dāng)于75%O2max），運(yùn)動(dòng)10min，休息10min，坡度為0°，重復(fù)4次的間歇運(yùn)動(dòng)建立EP模型。在EP前，進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練5min，速度從15m／min逐漸增加到30m／min，EP結(jié)束后5min內(nèi)速度由30m／min逐漸減至15m／min后終止。

1.3 力竭致心肌損傷的方案

EE組大鼠進(jìn)行一次力竭運(yùn)動(dòng)，開始速度為15m／min，在5min中之內(nèi)逐漸升高至30m／min，而后維持該運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度直至大鼠力竭。LEP＋EE組在進(jìn)行EP后24h進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)。

1.4 動(dòng)物取材

大鼠10%水合氯醛（40mg／100g體重）腹腔注射麻醉后，呈仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，于劍突下橫切口打開腹腔，下腔靜脈取血5ml，靜置15～30min，3 000rpm離心15min，取血清，－4℃保存，用于血清cTnI含量的測(cè)定。每組隨機(jī)抽取10只大鼠打開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針頭，快速滴注0.85%生理鹽水250～300ml，期間迅速剪斷下腔靜脈使血液流出，同時(shí)緩慢注入2ml 1%肝素，待流出液基本無血色后，換4%多聚甲醛溶液250～300ml快速滴注，整個(gè)滴注時(shí)間約在30min內(nèi)完成。取出心臟，放置4%多聚甲醛溶液中后固定24h，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，用于心肌εPKC免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)。其余大鼠迅速開胸取心，生理鹽水漂洗后置于液氮保存待用，用于心肌εPKC免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.5 血清cTnI含量的免疫化學(xué)發(fā)光法測(cè)定

應(yīng)用免疫化學(xué)發(fā)光發(fā)測(cè)定血清cTnI含量。該法應(yīng)用雙抗體一步夾心免疫酶分析法，以單克隆抗cTnI IgG抗體包被的磁性微粒作為捕獲試劑，用連接MAb的堿性磷酸酶檢測(cè)結(jié)合的cTnI，未結(jié)合的抗體則被洗去，隨后加入化學(xué)發(fā)功底物，產(chǎn)生的信號(hào)直接與結(jié)合cTnI量成比例。儀器為Beckman coulter公司的Access 2immunoassay system（全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定系統(tǒng)），試劑由儀器生產(chǎn)廠家配套提供。

1.6 心肌組織εPKC免疫印跡實(shí)驗(yàn)

采用western blot方法。心肌組織4℃解凍，冰浴下剪碎放入EP管中，加入預(yù)冷蛋白抽提試劑低溫勻漿，低溫離心機(jī)14 000xg，離心15min收集上清。采用BCA（bicinchonininc acid）法測(cè)定蛋白濃度。4℃SDS-PAGE電泳，樣品首先于80V恒定電壓下電泳至染料接近分離膠頂端，后用120V恒定電壓電泳，直至溴酚藍(lán)剛出膠底部，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（4℃200mA恒定電流下2h）。5%BSA溶液中室溫孵育1h，加入εPKC一抗（鼠抗人1∶3 000，美國Santa Cruz公司），4℃過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗（兔抗鼠IgG，1∶5 000），室溫孵育膜1h，TBST洗膜后加入化學(xué)底物發(fā)光，用X光膠片曝光，圖片掃描，采用Image J分析軟件測(cè)定每一樣品特異性條帶及對(duì)應(yīng)的GAPDH條帶灰度值。按相對(duì)灰度值＝εPKC蛋白灰度值／GAPDH灰度值計(jì)算樣品的相對(duì)灰度值，代表εPKC蛋白水平變化。

1.7 心肌組織εPKC免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行εPKC免疫組織化學(xué)檢測(cè)。制作常規(guī)石蠟切片，切片脫蠟至水；3%過氧化氫室溫10min；滴加復(fù)合消化液5min；室溫血清封閉20min；滴加一抗（兔抗人1∶50，美國Santa Cruz公司）4℃濕盒內(nèi)孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG，武漢博士德公司）37℃濕盒孵育20min；滴加SABC試劑37℃濕盒內(nèi)孵育20min；DAB室溫顯色；蘇木精復(fù)染；常規(guī)脫水透明封片；用PBS代替一抗，并以相鄰切片做陰性對(duì)照；反應(yīng)結(jié)果在Olympus顯微鏡下觀察，拍攝照片。將各組心肌組織εPKC免疫反應(yīng)切片隨機(jī)抽選5張，每張切片在光鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野，每組共25個(gè)視野。在計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)下經(jīng)行圖像采集，采用Image-Pro Plus 4.1圖像分析軟件處理，測(cè)量εPKC免疫反應(yīng)陽性表達(dá)面積與積分光密度（integrated optical density，IOD）。所得數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 16.0軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±SD）表示，組間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清cTnI免疫化學(xué)發(fā)光法測(cè)定

與C組相比，EE組血清cTnI水平明顯升高，差異具有顯著性（P＜0.05）；與EE組相比，LEP＋EE組血清cT-nI水平明顯下降，差異具有顯著性（P＜0.05；表1）。

2.2 大鼠心肌組織εPKC免疫印跡實(shí)驗(yàn)

各組大鼠心肌εPKC western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與C組相比，EE組、LEP組蛋白水平明顯升高，差異具有顯著性（0.98±0.34、0.87±0.31vs.0.64±0.08，P＜0.05）；與EE組相比，LEP＋EE組蛋白水平略微升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.05±0.07vs.0.98±0.34，P＞0.05；圖1）。

2.3 大鼠心肌組織εPKC免疫組織化學(xué)觀察

染色結(jié)果觀察可見εPKC免疫反應(yīng)陽性呈棕黃色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后，細(xì)胞核被染成淡藍(lán)色，心肌細(xì)胞間質(zhì)及其他細(xì)胞成分不著色。C組心肌細(xì)胞εPKC免疫反應(yīng)陽性點(diǎn)狀顆粒散在分布于胞漿內(nèi)，免疫反應(yīng)陽性顆粒稀疏（圖2-A），而用PBS代替一抗的相鄰切片陰性對(duì)照心肌細(xì)胞胞漿中沒有出現(xiàn)免疫反應(yīng)陽性結(jié)果；EE組、LEP組心肌細(xì)胞εPKC免疫反應(yīng)陽性較C組明顯增強(qiáng)，免疫反應(yīng)陽性顆粒聚集呈大顆粒狀或呈線狀分布于心肌細(xì)胞閏盤處，免疫染色明顯加深（圖2-B、圖2-D）；LEP＋EE組心肌細(xì)胞εPKC免疫反應(yīng)陽性較EE組明顯減弱，免疫反應(yīng)陽性顆粒呈點(diǎn)狀散在分布于胞漿中或細(xì)微顆粒彌散性分布于細(xì)胞胞漿中，免疫染色較淺（圖2-C）。

圖1 大鼠心肌組織εPKC蛋白水平的變化示意圖Figure 1. Changes of MyocardiumεPKC Expressions in Rats

εPKC免疫反應(yīng)表達(dá)圖像分析結(jié)果顯示，與C組相比，EE組與LEP組免疫反應(yīng)陽性面積明顯增加，IOD明顯升高，差異具有顯著性（P＜0.05）；與EE組相比，LEP＋EE組陽性面積明顯減少，IOD明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05；表2）。

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)晚期心肌保護(hù)效應(yīng)

EP對(duì)心臟的晚期保護(hù)效應(yīng)已被不少研究證實(shí)。Yamashita等［33］對(duì)大鼠進(jìn)行一次跑速為23～27m／min，持續(xù)時(shí)間為30min的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)EP晚期心肌保護(hù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)一次短暫的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以提高心肌對(duì)缺血再灌注的損傷的耐受力，心肌梗塞面積明顯減少。Domench等［11］、Parra等［25］在犬的實(shí)驗(yàn)中用一次速度為6km／h，持續(xù)時(shí)間為5min，間隔5min重復(fù)5次的間歇跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)24h后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，心肌梗死面積較對(duì)照組分別減小46%與56%，提示，運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)EP晚期保護(hù)效應(yīng)的產(chǎn)生并減少冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成的心肌梗死面積。本課題組［1，32］前期研究中也發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠進(jìn)行一次跑速為28～30m／min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間10min，休息10min，間隔訓(xùn)練4次的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)晚期運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)效應(yīng)，通過cTnI指標(biāo)檢測(cè)與HBFP染色圖像處理后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)心肌的晚期預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用，減輕異丙腎上腺素所致心肌損傷。目前國內(nèi)、外關(guān)于EP晚期的研究中大多用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈造成心肌缺血缺氧后灌注或以藥物手段模擬急性心肌缺血缺氧以探討EP晚期對(duì)心肌的保護(hù)效應(yīng)與機(jī)制，采用力竭造成運(yùn)動(dòng)損傷以探討EP晚期對(duì)心肌的保護(hù)作用的研究十分稀少。本實(shí)驗(yàn)在EP 24h后對(duì)大鼠進(jìn)行一次速度為30m／min（相當(dāng)于75%O2max），坡度為0°的力竭運(yùn)動(dòng)，探討EP是否在力竭運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮其晚期心肌保護(hù)效應(yīng)。

圖2 大鼠心肌組織εPKC免疫反應(yīng)結(jié)果（×400）Figure 2. Immunoreaction Results ofεPKC in Rat Myocardium（×400）

表2 本研究大鼠心肌組織εPKC免疫反應(yīng)圖像分析結(jié)果一覽表Table2εPKC Immunoreaction Image Analysis Results in Myocardium

本實(shí)驗(yàn)采用血清cTnI評(píng)價(jià)心肌損傷程度。心肌肌鈣蛋白（cardiac Troponin，cTn）是心肌肌原纖維中細(xì)肌絲上的收縮調(diào)節(jié)蛋白，其3個(gè)亞基為cTnT、cTnC、cTnI。cTn少數(shù)分布于心肌細(xì)胞胞漿中，多數(shù)與肌球蛋白結(jié)合固定存在于心肌纖維上，當(dāng)心肌細(xì)胞受損或細(xì)胞膜破損時(shí)，其胞質(zhì)內(nèi)游離的cTn可迅速地由心肌細(xì)胞透出進(jìn)入血液循環(huán)，血清cTn少量、暫時(shí)升高，伴隨心肌損傷加重，結(jié)合在心肌纖維上的cTn被降解并不斷地釋放到血液當(dāng)中，血清cTn濃度持續(xù)升高［30］。cTn亞基cTnI對(duì)心肌損傷具有高度的特異性與靈敏性，常用來評(píng)價(jià)心肌損傷。國內(nèi)、外均有采用血清cTnI評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的報(bào)道。Shave等［31］研究健康男性進(jìn)行一次大強(qiáng)度的劇烈運(yùn)動(dòng)，在運(yùn)動(dòng)前、運(yùn)動(dòng)中、運(yùn)動(dòng)30min后檢測(cè)血清cTnI的水平變化發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動(dòng)過程中，50%以上的男性血清cTnI有所升高，25%的男性血清cTnI在運(yùn)動(dòng)后3～4h顯著升高，表明了大強(qiáng)度的劇烈運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致心肌損傷。本課題組前期研究也采用血清cTnI來評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷，通過血清cTnI指標(biāo)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)心肌的晚期預(yù)適應(yīng)效應(yīng)，減輕異丙腎上腺素與力竭運(yùn)動(dòng)所致心肌損傷［1，5，32］，表明血清cTnI可以作為評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的標(biāo)準(zhǔn)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組相比，LEP組大鼠血清cTnI水平未發(fā)生變化，提示，EP沒有造成大鼠急性心肌損傷；而EE組大鼠血清水平顯著升高，提示，一次大強(qiáng)度的力竭運(yùn)動(dòng)造成了大鼠心肌急性損傷。與EE組相比，LEP＋EE組的大鼠血清cTnI水平明顯降低，提示，EP對(duì)急性心肌缺血損傷具有晚期保護(hù)作用，可以明顯減輕力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的急性心肌缺血損傷的程度。

3.2 心肌εPKC生物學(xué)概述

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是由Nishizuka等人于1977年首次發(fā)現(xiàn)的一組磷脂依賴性Ca2＋激活的蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶，由相對(duì)分子質(zhì)量為77～83KD的單一多肽單鏈構(gòu)成［35］。目前，在生物體細(xì)胞中已至少發(fā)現(xiàn)PKC的13種亞型。在IP研究中主要著重于α、δ、ε、η、θPKC等亞型。εPKC屬于nPKC中的一員，其在細(xì)胞生長、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化等多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中均發(fā)揮著重要作用［6，13］。

安靜狀態(tài)下，PKC在細(xì)胞胞漿中無活性，活化時(shí)，PKC磷酸化后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞胞膜與線粒體并被激活［22］。在IP機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，εPKC在IP保護(hù)效應(yīng)中的作用尤為重要，εPKC通過磷酸化其下游的眾多效應(yīng)蛋白如KATP敏感性鉀離子通道（sarcolemmal KATPchannels，sarc KATP）與線粒體KATP敏感鉀通道（mitochondrial KATP，mito KATP）的開放，減輕細(xì)胞腫脹，減少細(xì)胞能量消耗［24］。具體為反復(fù)短暫的缺血再灌注引發(fā)線粒體大量釋放ROS，ROS堆積觸發(fā)腺苷的釋放，從而激活G蛋白偶聯(lián)受體-PLC-DAG-εPKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化后的εPKC轉(zhuǎn)位并促使線粒體KATP通道與肌漿網(wǎng)L型Ca2＋通道的開放，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用［15］。εPKC在IP中也可通過抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的開放、增加εPKC與縫隙連接蛋白（connexin-43，Cx43）的復(fù)合體，降低心肌縫隙連接蛋白的通透性［7，21，34］，誘導(dǎo)心肌保護(hù)效應(yīng)。PKC家族成員的活性與其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位都受PKC自身在可催化區(qū)3個(gè)活化位點(diǎn)磷酸化的影響。其中，εPKC的3個(gè)活化位點(diǎn)為：位于活化環(huán)的Thr566、位于轉(zhuǎn)角的Thr710、位于疏水端的Ser729，εPKC在Ser729磷酸化位點(diǎn)的磷酸化在調(diào)控εPKC活性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［9］。

3.3 運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)晚期效應(yīng)中εPKC變化及可能機(jī)制

研究者在對(duì)EP誘導(dǎo)的心肌保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，EP晚期保護(hù)效應(yīng)期心肌的抗氧化能力提高，熱休克蛋白表達(dá)增多［18，19］，ATP敏感鉀離子通道蛋白表達(dá)增加［4］，心肌環(huán)氧合酶-2活性的增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的增多等［14，29］，為進(jìn)一步的研究εPKC在EP心肌保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。迄今為止，國內(nèi)、外對(duì)EP晚期效應(yīng)中PKC各個(gè)亞型的變化研究較少，國內(nèi)、外對(duì)PKC亞型εPKC在EP晚期效應(yīng)期分布及其表達(dá)尚無報(bào)道，εPKC是否為晚期EP心肌保護(hù)作用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的關(guān)鍵中介物質(zhì)目前都尚未有定論。

εPKC在IP中為介導(dǎo)心肌保護(hù)效應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)。Ping［26］等采用western blot檢測(cè)εPKC水平變化，發(fā)現(xiàn)IP可促使心肌中εPKC的大量表達(dá)，εPKC可能通過激活下游Lck通路，作用于下游效應(yīng)蛋白KATP通道、MPTP等，減輕I／R損傷，發(fā)揮IP的心肌保護(hù)效應(yīng)。Saurin［28］等發(fā)現(xiàn)，εPKC可能為IP誘導(dǎo)心肌保護(hù)效應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)，在敲除εPKC基因的小鼠中IP不能減輕小鼠的心肌梗塞面積。Lange［17］等采用western blot法研究長期的血管緊張素Ⅱ受體-1拮抗劑對(duì)εPKC的影響發(fā)現(xiàn)，εPKC蛋白水平顯著升高，血管緊張素Ⅱ受體-1拮抗劑激活εPKC心肌保護(hù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使心肌梗死面積減少。部分研究者參照εPKC在IP中發(fā)揮的效應(yīng)以及可能機(jī)制對(duì)εPKC在運(yùn)動(dòng)中的變化做了研究發(fā)現(xiàn)，εPKC的激活在運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)中的作用可能與IP中作用類似。Carson等［8］對(duì)大鼠進(jìn)行一次速度為23m／min，持續(xù)時(shí)間20min的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后采用western blot測(cè)定εPKC在心肌細(xì)胞膜的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與他的研究假設(shè)相反的是，一次運(yùn)動(dòng)后心肌細(xì)胞膜εPKC表達(dá)減少，但心肌細(xì)胞胞質(zhì)中εPKC在Ser729磷酸化位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)增加，其心肌保護(hù)機(jī)制可能是εPKC磷酸化并激活下游效應(yīng)蛋白，發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)。以上結(jié)果研究提示，心肌εPKC可能通過εPKC蛋白水平的增加或εPKC在Ser729磷酸化位點(diǎn)的磷酸化增多激活下游εPKC-ERK／Lck信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而減輕心肌I／R損傷，減少心肌梗塞面積。Qiu［27］等在IP中對(duì)心肌εPKC的研究發(fā)現(xiàn)，εPKC活化后可轉(zhuǎn)移至心肌閏盤與線粒體，發(fā)揮其對(duì)心肌的晚期保護(hù)效應(yīng)。

本次實(shí)驗(yàn)采用western blot法檢測(cè)心肌組織中εPKC蛋白水平的變化，結(jié)合免疫組織化學(xué)方法觀察運(yùn)動(dòng)后心肌組織中εPKC表達(dá)位置變化及半定量分析其表達(dá)變化，結(jié)果表明，安靜狀態(tài)下εPKC免疫陽性反應(yīng)呈點(diǎn)狀顆粒散在分布于胞漿內(nèi)，免疫反應(yīng)陽性顆粒稀疏；與Carson［8］的研究結(jié)果不同，EP晚期εPKC蛋白水平較安靜狀態(tài)下明顯升高，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示εPKC免疫反應(yīng)陽性大部分發(fā)生轉(zhuǎn)膜現(xiàn)象，集中分布于心肌細(xì)胞的閏盤處，免疫陽性染色深。這證實(shí)了Newton［22］與Qiu［27］的研究結(jié)果，活化后的εPKC可向心肌閏盤轉(zhuǎn)位，發(fā)揮EP晚期心肌保護(hù)效應(yīng)。εPKC向心肌細(xì)胞膜聚集原因可能為εPKC轉(zhuǎn)位并激活后通過作用于其下游效應(yīng)物質(zhì)如與Cx43形成復(fù)合物共同表達(dá)于大鼠心肌細(xì)胞連接處，或者轉(zhuǎn)位于sarcKATP上維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。大強(qiáng)度的力竭運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血、缺氧增加，造成急性心肌損傷。力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌細(xì)胞εPKC蛋白水平顯著升高，免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈顆粒狀分布于細(xì)胞胞漿或在心肌細(xì)胞閏盤聚集呈線狀分布，免疫陽性染色深。其可能原因?yàn)?，大量εPKC可促使線粒體KATP通道與肌漿網(wǎng)L型Ca2＋通道的開放，促使K＋外流與Ca2＋釋放，抑制Ca2＋內(nèi)流與攝取，ATP能耗降低，心肌細(xì)胞Ca2＋超載程度明顯下降，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，進(jìn)一步抑制力竭運(yùn)動(dòng)所致心肌損傷。但Doble［12］等的研究表明，過表達(dá)無活性的εPKC使Cx43的磷酸化水平降低，從而不能行使εPKC的心肌保護(hù)功能。隨著力竭時(shí)間增長，力竭運(yùn)動(dòng)組可能存在大量無活性的εPKC轉(zhuǎn)位于心肌細(xì)胞膜上，導(dǎo)致其自身磷酸化水平降低，心肌保護(hù)作用減弱。同時(shí)，EP后再進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)致εPKC蛋白水平顯著升高，但與力竭運(yùn)動(dòng)組不同，εPKC并沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，免疫陽性顆粒散在分布于心肌細(xì)胞胞漿中。由于本次實(shí)驗(yàn)中沒有檢測(cè)磷酸化的εPKC的蛋白水平與位置表達(dá)，根據(jù)EP對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)的晚期心肌保護(hù)效應(yīng)推測(cè)，磷酸化并激活的εPKC向心肌閏盤與細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位并激活下游效應(yīng)物質(zhì)可能是EP晚期心肌保護(hù)效應(yīng)的關(guān)鍵因素。Cenni［9］的研究也表明，εPKC在Ser729磷酸化位點(diǎn)的磷酸化在調(diào)控εPKC活性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，進(jìn)一步的研究應(yīng)著重檢測(cè)εPKC磷酸化位點(diǎn)Ser729的蛋白水平的變化與εPKC下游效應(yīng)物質(zhì)的蛋白水平變化，從而揭示εPKC在EP中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

4 結(jié)論

EP作為一種無損傷性預(yù)適應(yīng)方式，能夠減輕力竭運(yùn)動(dòng)致急性心肌損傷的程度，EP對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)致急性心肌損傷具有晚期保護(hù)效應(yīng)。在EP晚期保護(hù)效應(yīng)中，大鼠心肌組織εPKC的蛋白水平升高，εPKC向心肌細(xì)胞閏盤轉(zhuǎn)位，表明εPKC參與了EP誘導(dǎo)的晚期心肌保護(hù)效應(yīng)。

［1］馬治云，潘珊珊，申毓軍，等.心肌分子標(biāo)志物NT-proBNP在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用［J］.體育科學(xué)，2011，31（12）：55-61.

［2］申毓軍，潘珊珊.運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)效應(yīng)與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究現(xiàn)狀和展望［J］.上海體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，34（6）：55-58.

［3］王凱，潘珊珊.ATP敏感鉀通道介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)心肌保護(hù)作用的研究進(jìn)展［J］.體育科學(xué)，2011，31（8）：59-64.

［4］王凱，潘珊珊，王慶棠.心肌SarcKATP通道kir6.2亞基在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)效應(yīng)中變化的研究［J］.體育科學(xué)，2012，32（4）：60-66，83.

［5］鐘旭，潘珊珊.運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠急性心肌缺血損傷早期保護(hù)作用的研究［J］.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2009，28（3）：260-263.

［6］BASU A，SIVAPRASAD U.Protein kinase C epsilon makes the life and death decision［J］.Cell Signal，2007，19（8）：1633-1642.

［7］BOWLING N，HUANG X，SANDUSKY G E，et al.Protein kinase C-alpha and-epsilon modulate connexin-43phosphorylation in human heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33（4）：789-798.

［8］CARSON LD，KORZICK D H.Dose-dependent effects of acute exercise on PKC levels in rat heart：is PKC the heart’s prophylactic？［J］.Acta Physiol Scand，2003，（178）：97-106.

［9］CENNI V，DOPPLER H，SONNENBURG E D，et al.Regulation of novel protein kinase Cεby phosphorylation［J］.Biochem J，2002，363（Pt3）：537-545.

［10］COSTA A D，GARLID K D.Intra mitochondrial signaling：interactions among mitoKATP，PKC epsilon，ROS，and MPT［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295（2）：874-882.

［11］DOMENECH R J，MACHO P，SCHWARZE H，et al.Exercise induces early and late myocardial preconditioning in dogs［J］.Cardiovasc Res，2002，55（3）：561-566.

［12］DOBLE B W，PING P，KARDAMI E.The epsilon subtype of protein kinase C is required for cardiomyocyte connexin-43 phosphorylation［J］.Circ Res，2000，86（3）：293-301.

［13］DUQUESNES N，LEZOUAL’H F，CROZATIER B.PKC-delta and PKC-epsilon：foes of the same family or strangers［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，51（5）：665-673.

［14］GOLBIDI S，LAHER I.Molecular mechanisms in exercise-induced cardio-protection［J］.Cardiol Res Pract，2011，6：1-15.

［15］GRANT R B，ERIC N C，Daria M R.Cardioprotective mechanisms of PKC isozyme-selective activators and inhibitors in the treatment of ischemia-reperfusion injury［J］.Pharmacological Res，2007，55（6）：523-536.

［16］KOICHI I，ERIC C，DARIA M R.Epsilon protein kinase C as a potential therapeutic target for the ischemic heart［J］.Cardiovasc Res，2006，70（2）：222-230.

［17］LANGE S A，WOLF B，SCHOBER K，et al.Chronic angiotensin II receptor blockade induces cardioprotection during ischemia by increased PKC-epsilon expression in the mouse heart［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2007，49（1）：46-55.

［18］LENNON S L，QUINDRY J C，F(xiàn)RENCH J P，et al.Exercise and myocardial tolerance to ischaemia-reperfusion［J］.Acta Physiol Scand，2004，182（2）：161-169.

［19］MELLING C W，THORP D B，MILNE K J，et al.Myocardial Hsp70phosphorylation and PKC-mediated cardioprotection following exercise［J］.Cell Stress Chaperones，2009，14（2）：141-150.

［20］MURRY C E，JENNINGS R B，REIMER K A，et al.Preconditioning with ischemia：a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124-1136.

［21］NAITOH K，YANO T，MIURA T，et al.Roles of Cx43-associated protein kinases in suppression of gap junction-mediated chemical coupling by ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296（2）：396-403.

［22］NEWTON A C.Protein kinase c：structural and spatial regulation by phosphorylation，cofactors，and macromolecular interactions［J］.Chem Rev，2001，101：2353-2364.

［23］O’Brien P J，Smith DEC，Knechtel TJ，et al.Cardiac troponin I is a sensitive，specific biomarker of cardiac injury in laboratory animals［J］.Laboratory Animals，2006，40（5）：153-171.

［24］OHNUMA Y，MIURA T，MIKI T，et al.Opening of mitochondrial K（ATP）channel occurs downstream of PKC-epsilon activation in the mechanism of preconditioning［J］.Am J Physiol，2002，283（1）：440-447.

［25］PARRA V M，MACHO P，DOMENECHR J.Late cardiac preconditioning by exercise in dogs is mediated by mitochondrial potassium channels［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2010，56（3）：268-274.

［26］PING P，SONG C，ZHANG J，et al.Formation of protein kinase C epsilon Lck signaling modules confers cardioprotection［J］.J Clin Invest，2002，109（4）：499-507.

［27］QIU Y，PING P，TANG X L，et al.Direct evidence that protein kinase C plays an essential role in the development of late preconditioning against myocardial stunning in conscious rabbits and that epsilon is the isoform involved［J］.J Clin Invest，1998，101（10）：2182-2198.

［28］SAURIN A T，PENNINGTON D J，PAAT N J，et al.Targeted disruption of protein kinase C epsilon gene abolishes the infarct size reduction that follows ischaemic preconditioning of isolated buffer-perfused mouse hearts［J］.Cardiovasc Res，2002，55（3）：672-680.

［29］SCOTT K P，JOHN C Q，ANDREAS N K.Exercise-induced cardio-protection against myocardial ischemia-reperfusion injury［J］.Free Radical Biology Med，2008，（44）：198-201.

［30］SHAVE R，BAGGISH A，GEORGE K，at al.Exercise-Induced Cardiac Troponin Elevation：Evidence，Mechanisms，and Implications［J］.J Am Coll Cardiol，2010，56（3）：169-176.

［31］SHAVE R，ROSS P，LOW D，et al.Cardiac troponin I is released following high-intensity short-duration exercise in healthy humans［J］.Int J Cardiol，2010，145（2）：337-339.

［32］SHEN Y J，PAN S S，ZHUANG T，et al.Exercise preconditioning initiates late cardioprotection against isoproterenol-induced myocardial injury in rats independent of protein kinase C［J］.J Physiol Sci，2011，61（1）：13-21.

［33］YAMASHITA N，BAXTER F，YELLON D M.Exercise directly enhances myocardial tolerance to ischemia-reperfusion injury in the rat through a protein kinase C mediated mechanism［J］.Heart，2001，85（3）：331-336.

［34］YANG X L，COHEN M V，DOWNEY J M.Mechanism of cardioprotection by early ischemic preconditioning［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24（3）：225-234.

［35］ZENG L，WEBSTER S V，NEWTON P M.The biology of protein kinase C［J］.Adv Exp Med Biol，2012，740：639-661.

Changes ofεPKC Expression during Exercise Preconditioning induced-Late Myocardial Protection in Rats

HAO Zhe，PAN Shan-shan

Objective：To determine whether exercise preconditioning（EP）is capable of protecting myocardium from exhaustive exercise and view the change ofεPKC expression during exercise preconditioning.Methods：SD rats were divided into control group（C），EE group，LEP group，LEP＋EE group.After establishing of EP animal model，exhaustive exercise on treadmill for inducing myocardial injury.Then the level of cTnI was detected by chemiluminescent immunoassay.Western blotting method was used to detect changes ofεPKC，immunohistochemistry method was used to observe expressions ofεPKC.Results：As compared with the group C，the cTnI level in serum increased significantly，εPKC significantly increased andεPKC translocated from the soluble to the intercalated disk in group EE.While compared with the group C，there was no significant difference in the cTnI level in group LEP，butεPKC significantly increased and theεPKC translocated from the soluble to the intercalated disk.As compared with the group EE，the cTnI level in serum decreased significantly in group LEP＋EE，there was no significant difference inεPKC level and there was no expression at intercalated disk.Conclusion：Exercise preconditioning induced-late myocardial protection against exhaustive exercise injury andεPKC participated in late cardioprotection induced by exercise preconditioning.

εPKC；exercisepreconditioning；latecardioprotection；exhaustiveexercise；myocardialinjury；rat；animalexperiment

G804.2

A

1000-677X（2012）07-0039-06

2012-04-16；

2012-06-26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31071031）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)資助項(xiàng)目（09490503300）。

郝喆（1987-），女，河南開封人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管形態(tài)和機(jī)能，E-mail：sldhz1987＠126.com；潘珊珊（1957-），女，江蘇常州人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管形態(tài)和機(jī)能，Tel：（021）51253252，E-mail：panshanshan＠yahoo.com.cn。

上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海200438 School of Sports Science，Shanghai University of Sport，Shanghai 200438，China.