李文媛，王瑩，劉洋，佟曉杰

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，a解剖教研室，b病原生物學(xué)教研室，牡丹江157011;2.中國醫(yī)科大學(xué)解剖教研室)

·基礎(chǔ)研究·

脂肪源性干細胞穴位注射對大鼠腦缺血再灌注后胰島素樣生長因子1及其受體表達的影響

李文媛1a，王瑩1a，劉洋1b，佟曉杰2

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，a解剖教研室，b病原生物學(xué)教研室，牡丹江157011;2.中國醫(yī)科大學(xué)解剖教研室)

目的 探討脂肪源性干細胞(ADSC)穴位注射對大鼠缺血/再灌注損傷后胰島素樣生長因子1 (IGF-1)及其受體(IGF-1R)表達的影響。方法 線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)2 h再灌注模型，大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、穴位注射ADSC組(治療組)、穴位注射0.9%氯化鈉注射溶液組(對照組)。治療組取在大椎、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴位注射PKH-26標記ADSC細胞懸液。缺血72 h后NSS法檢測神經(jīng)功能恢復(fù)，采用實時熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)方法檢測IGF-1、IGF-1R蛋白和mRNA的表達。結(jié)果 治療組可見PKH26標記的ADSC在海馬區(qū)有表達。與模型組和對照組比較，穴位注射ADSC組NSS評分顯著降低(P＜0.05)，海馬區(qū)IGF-1、IGF-1R蛋白和mRNA表達顯著增加(P＜0.05)。結(jié)論 穴位移植脂肪源性干細胞對大鼠腦缺血再灌注有神經(jīng)保護作用，其作用機制可能與促進海馬區(qū)IGF-1和IGF-1R表達有關(guān)。

再灌注損傷;干細胞移植;胰島素樣生長因子Ⅰ;受體，IGF1型;大鼠，sprague-dawley

干細胞移植治療腦缺血性疾病是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個熱點，其中脂肪源性干細胞(ADSC)由于其來源廣、易于體外擴增純化，因此已成為進行干細胞移植的一個理想來源，我們前期研究發(fā)現(xiàn)［1］ADSC可以選擇性地遷移并且作用于受損的腦組織，促進血管生成和神經(jīng)再生，并促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。胰島素樣生長因子1(IGF-1)是一種多肽生長因子，在正常腦組織的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，有研究表明IGF-1與其受體(IGF-1R)結(jié)合后［2］可激活受體酪氨酸激酶(RTK)，促進神經(jīng)元細胞增殖、分化和遷移，可發(fā)揮神經(jīng)保護效應(yīng)。目前關(guān)于ADSC移植對腦缺血損傷中IGF-I和IGF-1R的影響尚不明確。而且以往干細胞治療的移植途徑較為局限，導(dǎo)致移植后干細胞向腦損傷區(qū)遷移能力及存活率較低，其神經(jīng)再生效果并不理想［3］。為此我們將中醫(yī)穴位注射與干細胞治療結(jié)合，觀察脂肪源性干細胞穴位移植對腦缺血損傷IGF-1及其受體IGF-1R表達的影響，為ADSC穴位注射治療腦缺血損傷提供新的實驗依據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品及試劑 雄性SD大鼠24只，清潔級，體質(zhì)量280～320 g，購于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(許可證號:SYXK［遼］2003-0013)。兔抗大鼠IGF-1抗體、兔抗大鼠IGF-1R抗體、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中山生物技術(shù)有限公司。PKH-26試劑盒購于美國sigma公司。TRIzol試劑、SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs購自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA標志物購自日本Takara公司，IGF-1、IGF-1R和β-actin引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 ADSC培養(yǎng)及PKH26標記 脂肪組織由中國醫(yī)科大學(xué)整形外科提供，來自于25～35歲要求去除腹部多余脂肪的健康成人，供體無傳染病及內(nèi)分泌疾病，男女比例為2∶8。告知其脂肪抽吸物將用于科學(xué)研究并知情同意。脂肪源性干細胞參照Zuk等［1］的方法進行分離培養(yǎng)，并換液傳代，分離培養(yǎng)取第3～5代的ADSC，制成單細胞懸液后，參照Tohill［1］的方法進行PKH26標記ADSC。

1.3 動物分組與模型制備 大鼠按體質(zhì)量分層，隨機分為4組:假手術(shù)組(n=12)、模型組(n=12)、穴位注射ADSC組(治療組，n=12)、穴位注射0.9%氯化鈉注射溶液組(對照組，n=12)。參照Longa等［4］的線栓改良法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血模型。模型組:單純造模，不予任何干預(yù);治療組和對照組于建模成功后3 h，取在大椎、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴位［5］注射等體積的PKH-26標記ADSC細胞懸液(1×106細胞/穴)和0.9%氯化鈉注射溶液。

1.4 神經(jīng)功能評估 采用Chen等［6］報道的神經(jīng)功能損害評分表(NSS)，從運動、感覺、反射、平衡4方面進行神經(jīng)功能損害評估，22分為最嚴重的神經(jīng)功能損害，即評分越高神經(jīng)功能損害越嚴重。缺血后72 h各組大鼠分別進行NSS評分。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 嚴格按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明的步驟進行，其中一抗?jié)舛菼GF-1(1∶100)、IGF-1R(1∶100)。以PBS代替一抗作陰性對照。陽性率的定量分析:每個標本取4張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬區(qū)隨機選5個視野，用計算機圖像分析系統(tǒng)(HPIAS-1000)對各組陽性細胞進行吸光度(absorbance，A)分析。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 總RNA提取，采用Zacharek等［1］報道方法進行 PCR反轉(zhuǎn)錄、檢測及熒光定量分析。引物設(shè)計及合成按照已報道的序列設(shè)計并合成VEGF以及內(nèi)參照β肌動蛋白β-actin的特異性引物。各引物的序列為: IGF-1:上游5'-CAAAATGAGCGCACCTCCAATA-3'，下游5'-TTGAGGGAAATGCCCATCTCTG-3';IGF-1R:上游5'-AAACGCTGACCTCTGTTACCTCTC-3'，下游5'-GCGGATGAAGCCTGATGGAC-3';β-actin:上游5'-TGAAGGTCGGTGTCAACGGA-3'，下游5'-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'。根據(jù)標準曲線將各樣品測得的Ct值換算成拷貝數(shù)，分析各檢測樣本中目的基因拷貝數(shù)相對于陽性定量參考樣品的基因拷貝數(shù)，分析方法利用2-△△CT方法。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)以采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ADSC的培養(yǎng) 相差顯微鏡下觀察，接種后24 h細胞貼壁，呈成纖維細胞樣外觀。培養(yǎng)48 h后可見細胞已經(jīng)充分伸展呈長梭形，72 h后開始聚集形成細胞集落，6 d形成較密集的細胞群落。

2.2 PKH-26標記觀察 冰凍切片免疫熒光追蹤PKH-26標記的移植ADSC，可見穴位注射ADSC組在海馬區(qū)有紅色熒光信號表達。而假手術(shù)組、模型組及對照組沒有發(fā)現(xiàn)紅色熒光信號。

2.3 ADSC穴位移植對NSS評分的影響 腦缺血后72 h，假手術(shù)組NSS評分為0，模型組、對照組和治療組NSS評分分別為(10.40±0.97)、(8.98± 0.33)和(6.47±0.51)，模型組、對照組和治療組NSS評分高于假手術(shù)組(P＜0.05)。與模型組比較，對照組和治療組NSS評分顯著降低(P＜0.05)，其中治療組NSS評分低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 ADSC穴位移植對IGF-1和IGF-1R表達的影響 IGF-1和IGF-1R陽性細胞胞漿著色，呈棕黃色或棕褐色。陰性細胞的細胞質(zhì)不著色。模型組、對照組和治療組NGF和BDNF蛋白表達較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.05)，其中治療組IGF-1和IGF-1R蛋白表達較模型組和對照組顯著增高(P＜0.05)，見表1。

表1 各組海馬區(qū)IGF-1和IGF-1R吸光度值(±s)

表1 各組海馬區(qū)IGF-1和IGF-1R吸光度值(±s)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.05;與模型組比較，bP＜0.05

IGF-1 IGF-1R假手術(shù)組組別 鼠數(shù)(只) 6 18.81±2.20 4.48±0.72模型組 6 41.04±8.02a11.91±1.01a對照組 6 40.98±4.39a10.79±2.28a治療組 6 80.62±8.48ab16.85±2.21ab

2.5 實時熒光定量PCR檢測 各組IGF-1和IGF-1R mRNA表達趨勢相同，模型組、對照組和治療組IGF-1和IGF-1R mRNA相對表達較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.05)，其中治療組IGF-1和IGF-1R mRNA相對表達較模型組和對照組顯著增高(P＜0.05)，而模型組和對照組IGF-1和IGF-1R mRNA之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組海馬區(qū)IGF-1和IGF-1R mRNA相對表達(2-ΔΔCt，±s)

表2 各組海馬區(qū)IGF-1和IGF-1R mRNA相對表達(2-ΔΔCt，±s)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.05;與模型組比較，bP＜0.05

IGF-1 IGF-1R假手術(shù)組組別 鼠數(shù)(只) 6 0.0115±0.0011 0.0022±0.0011模型組 6 0.0197±0.0022a0.0065±0.0021a對照組 6 0.0232±0.0062a0.0066±0.0007a治療組 6 0.0337±0.0004ab0.0104±0.0013ab

3 討論

近年來，隨著干細胞研究的不斷深入，干細胞移植治療成為腦缺血損傷的熱點，其中ADSC成為較為理想的選擇，與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，ADSC具有其獨特的優(yōu)勢［1］:(1)人類具有豐富的皮下脂肪，來源廣泛;(2)能夠通過安全的常規(guī)吸脂術(shù)獲得，取材方便;(3)脂肪組織中的間充質(zhì)干細胞的比例高于骨髓;(4)ADSC增殖速度快于骨髓間充質(zhì)干細胞。但傳統(tǒng)的干細胞給藥方式，如外周靜脈注射，腹腔注射，肌內(nèi)注射，對移植后干細胞向缺血區(qū)遷移以及存活影響較大，不能較好的發(fā)揮干細胞促進神經(jīng)再生的作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)［7］通過穴位注射骨髓間充質(zhì)干細胞治療心肌梗死大鼠，能顯著提高缺血心肌細胞的修復(fù)重建能力，療效優(yōu)于傳統(tǒng)移植途徑。為此，本實驗將穴位注射穴位療法和干細胞作用結(jié)合在一起，選取調(diào)督開竅、化癖通絡(luò)的督脈大椎穴、心包經(jīng)的內(nèi)關(guān)穴［5］進行干細胞穴位注射治療腦缺血大鼠模型。本研究結(jié)果表明穴位注射ADSC組海馬區(qū)有大量存活的PKH-26標記的ADSC，證實了穴位注射ADSC能夠沿著經(jīng)線通過血腦屏障進入宿主腦內(nèi)，遷移至缺血性損傷區(qū)域發(fā)揮作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)穴位注射ADSC組神經(jīng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于模型組和對照組，說明穴位注射干細胞能夠較好的發(fā)揮神經(jīng)功能恢復(fù)作用。

IGF-1是一種多肽生長因子，在正常腦組織的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，有研究表明［8］IGF-1在體內(nèi)外不同的損傷模型中有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護效應(yīng)，有研究表明腦損傷后IGF-1與受體IGF-1R的結(jié)合后可發(fā)揮神經(jīng)恢復(fù)效應(yīng)，調(diào)整腦屏障通透性，減少興奮性中毒損傷，抑制細胞凋亡，并增加血管發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生。本實驗中，穴位注射ADSC組IGF-1和IGF-1R蛋白及mRNA表達較模型組和對照組顯著增高，NSS評分顯著降低，提示穴位注射ADSC能夠通過分泌和上調(diào)IGF-1和IGF-1R的表達，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，這與以往研究結(jié)果相一致［2］。

綜上所述，穴位移植脂肪源性干細胞對大鼠腦缺血再灌注有神經(jīng)保護作用，其作用機制可能與促進IGF-1和IGF-1R表達有關(guān)。

［1］ 王瑩，李文媛，李明秋，等.黃芪皂苷Ⅳ聯(lián)合脂肪源性干細胞對老齡大鼠腦缺血再灌注中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2011，31(20):3963-3966.

［2］ Zhang J，Li Y，Chen J，et al.Expression of insulin-like growth factor 1 and receptor in ischemic rats treated with human marrow stromal cells［J］，Brain Res，2004，1030 (1):19-27.

［3］ Müller-Ehmsen J，Krausgrill B，Burst V，et al.Effective engraftment but poor mid-term persistence of mononuclear and mesenchymal bone marrow cells in acute and chronic rat myocardial infarction［J］.Mol Cell Cardiol，2006，41 (5):876-84.

［4］ 王瑩，李文媛，鄭海星，等.黃芪皂苷Ⅳ對大鼠腦缺血/再灌注損傷海馬神經(jīng)元凋亡及相關(guān)基因表達的影響［J］.中國臨床保健雜志，2011，14(4):401-403.

［5］ 孔立紅，毛娟娟，孫國杰.穴位埋藥對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響［J］.上海針灸雜志，2007，26 (7):40-42.

［6］ Chen C，Hu Q，Yan J，et al.Early inhibition of HIF-1alphawith small interfering RNA reduces ischemic-reperfused brain injury in rats［J］.Neurobiol Dis，2009，33(3):509-517.

［7］ 張哲，楊關(guān)林，陳巖，等.穴位移植同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞對梗死區(qū)心肌再生的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(25):4837-4841.

［8］ Boucher M，Pesant S，Lei YH，et al.Simultaneous administration of insulin-like growth factor-1 and darbepoetin alfa protects the rat myocardium against myocardial infarction and enhances angiogenesis［J］.Clin Transl Sci，2008，1(1):13-20.

Effect of acupoint injection with adipose－derived stem cell on the expression of insulin-like growth factor 1 and receptor after cerebral ischemia/reperfusion in rats

LI Wen-yuan*，WANG Ying，LIU Yang，TONG Xiao-jie (*Department of Anatomy，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China) Corresponding author:WANG Ying，E-mail:yingwang77022@163.com

Objective To investigate the effect of acupoint injection with adipose-derived stem cell on insulin-like growth factor 1(IGF-1)and receptor(IGF-1R)after cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods The rat model of middle cerebral artery occlusion was established in model.A total of 48 healthy SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，ADSC acupoint injection group(treatment group)and saline acupoint injection(control group).ADSC suspensions were marked with PKH-26 were infused into acupoints of"Dazhui"and" Neiguan"in the treatment group.72 h after reperfusion，neuological function score were observed by NSS.The expressions of IGF-1 and IGF-1R were observed by using immunohistochemical and quantitative real-time RT-PCR.Results

PKH-26 labeled ADSC were observed in hippocampus region of the treatment group.Compared with model and control group，the NSS and the expression of IGF-1，IGF-1R of the treatment group were significantly increased(P＜0.05).Conclusion ADSC acupoint injection could improve the neurological function in rats after cerebral ischemiareperfusion，which may be related to up-regulating IGF-1 and IGF-1R in hippocampus region.

Reperfusion injury;Stem cell transplantation;Insulin-like growth factorⅠ;Receptor，IGF type 1;Rats，Sprague-dawley

R743.31

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.023

2012-02-07)

黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計劃項目(1152G050);黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目(2010243)

李文媛，講師，E-mail:yuanyuan19800413@163.com

王瑩，講師，E-mail:yingwang770224@163.com