施冰，冬蘭，尹秋生，趙倩，王珺

(北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京100700)

·基礎(chǔ)研究·

大鼠心肌梗死后心肌組織中線粒體融合蛋白2基因和線粒體分裂蛋白mRNA表達(dá)水平的變化

施冰，冬蘭，尹秋生，趙倩，王珺

(北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京100700)

目的 觀察大鼠急性心肌梗死后梗死周邊區(qū)心肌組織中線粒體融合蛋白2基因(mfn2)和線粒體分裂蛋白(DRP1)表達(dá)水平的變化。方法 15只雄性SD大鼠通過(guò)前降支動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠急性心肌梗死模型后，隨機(jī)分為心肌梗死2 d組，心肌梗死7 d組，心肌梗死14 d組;另設(shè)假手術(shù)組，每組n=5。利用熒光定量PCR法檢測(cè)梗死周邊區(qū)心肌組織中Mfn2和Drp1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 心肌梗死組中Mfn2和Drp1 mRNA表達(dá)低于假手術(shù)組，并在心肌梗死后2周內(nèi)表達(dá)呈逐漸下降的趨勢(shì)(P＜0.05)。結(jié)論 線粒體融合和分裂異常導(dǎo)致的能量代謝障礙，可能是心肌梗死后心室重塑及心力衰竭的重要機(jī)制之一。

心肌梗死;基因，線粒體;線粒體，心臟;心血管生理過(guò)程;大鼠，sprague-dawley

心力衰竭是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，調(diào)查顯示心力衰竭的發(fā)病率在50歲以上人群為1%，而在80歲以上為10%。線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，其基本功能為生成三磷酸腺苷(ATP)，同時(shí)它還參與鈣離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及許多其他合成代謝和分解代謝。在心力衰竭的各種病理改變中，線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致的能量代謝障礙可能是心力衰竭發(fā)展過(guò)程的重要機(jī)制之一［1］。

細(xì)胞生命進(jìn)程中，線粒體管網(wǎng)進(jìn)行著不間斷地分裂和融合，兩者維持動(dòng)態(tài)平衡對(duì)細(xì)胞積極而靈敏地適應(yīng)環(huán)境具有重要意義。線粒體融合蛋白2基因(mfn2)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型基因，該基因位于線粒體的外膜，參與線粒體的融合，調(diào)節(jié)線粒體的新陳代謝和維持線粒體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［2-3］。Mfn2在心、腦、肺、腎、肝組織中廣泛分布，在心臟中表達(dá)最高。Mfn2是線粒體融合所必需的，融合基因缺陷可導(dǎo)致線粒體片斷化。線粒體分裂蛋白(DRP1)是線粒體分裂所必需的，分裂基因缺陷可導(dǎo)致線粒體管網(wǎng)化［4］。

本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠急性心肌梗死模型，探討心肌梗死后梗死周邊區(qū)心肌組織中 Mfn2和Drp1mRNA的表達(dá)變化，以期進(jìn)一步闡述心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)诖笫笮募」Ｋ篮笮呐K功能損傷中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的制備、分組及給藥 15只雄性SD大鼠，每只體質(zhì)量180 g左右，購(gòu)自北京維通利華公司。通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，制作急性心肌梗死模型。術(shù)后存活的15只大鼠隨機(jī)分為心肌梗死后2 d組，心肌梗死后7 d組，心肌梗死后14 d組(n =5)。另設(shè)假手術(shù)組(n=5)，假手術(shù)組僅在前降支穿線，不結(jié)扎。

1.2 心臟重量及重量指數(shù) 大鼠稱量體質(zhì)量(BW)后用復(fù)合麻醉劑(戊巴比妥鈉、水合氯醛、阿托品注射液)腹腔注射麻醉(3 ml/kg)，心臟抽血處死。取出心臟，于升主動(dòng)脈注入冰PBS灌流心臟，將心臟在濾紙上瀝干后稱取心臟重量;剪除雙側(cè)心耳、右心室壁，稱取左心重量(LVW)，左心重量與體質(zhì)量之比即為左心室重量指數(shù)(LVWI，mg/g)。

1.3 心肌組織中Mfn2和Drp1mRNA檢測(cè) 用Trizol法(美國(guó)Invitrogen公司)提取梗死周邊區(qū)心肌組織總RNA。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中Mfn2和Drp1 mRNA表達(dá)，18sRNA作為內(nèi)參，見表1。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)處理，Mfn2/18s和Drp1/18s吸光度比值分別作為Mfn2和Drp1mRNA的相對(duì)含量。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死模型的建立 成功構(gòu)建大鼠急性心肌梗死模型，實(shí)驗(yàn)用20只大鼠全部存活，根據(jù)研究設(shè)計(jì)分批處死。

2.2 大鼠心臟重量指數(shù) 與假手術(shù)組［(2.20± 0.23)mg/g］比較，心肌梗死后7 d組［(2.71± 0.23)mg/g］及14 d［(2.93±0.11)mg/g］組大鼠左心重量與體質(zhì)量比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);術(shù)后2 d組［(2.26±0.34)mg/g］與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 心肌組織中Mfn2和Drp1mRNA的表達(dá) 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組心肌組織中Mfn2和 Drp1mRNA表達(dá)水平在心肌梗死后2周內(nèi)表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠心肌組織中Mfn2和Drp1表達(dá)(±s)

表2 各組大鼠心肌組織中Mfn2和Drp1表達(dá)(±s)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.05

Mfn2 Drp1假手術(shù)組組別 鼠數(shù)(只) 5 0.86±0.04 1.13±0.04術(shù)后2 d 5 0.65±0.07a0.97±0.04a術(shù)后7 d 5 0.46±0.05a0.84±0.08a術(shù)后14 d 5 0.32±0.03a0.75±0.05a

3 討論

在本試驗(yàn)中，心肌梗死組LVWI較假手術(shù)組減少，表明心肌梗死后發(fā)生心室重構(gòu)。在本試驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死后梗死周邊區(qū)心肌組織中Mfn2和Drp1 mRNA表達(dá)逐漸降低，提示Mfn2和Drp1的表達(dá)變化可能與心室重塑相關(guān)。

研究顯示，心肌線粒體生物合成的增加與心肌重構(gòu)之間存在著某種聯(lián)系，心肌重構(gòu)的過(guò)程可能引起線粒體生物合成通路的活化，而線粒體生物合成的增加有可能加重心肌重構(gòu)［5］。線粒體的總體形態(tài)(管網(wǎng)狀或片斷化)依賴于融合、分裂蛋白的相對(duì)活性。線粒體空間形態(tài)的動(dòng)力學(xué)變化與線粒體代謝、氧化磷酸化等密切相關(guān)。Mfn2是線粒體融合蛋白家族的主要成員，是線粒體維持形態(tài)、發(fā)揮功能所必需的重要分子。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與多種心血管疾病相關(guān)的病理生理過(guò)程，如高血壓、冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)后再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚、心肌氧化損傷、糖尿病和胰島素抵抗等。Mfn2可以通過(guò)抑制Ras/Raf/ ERK/MAPK途徑，從而有效地阻遏細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6-7］。敲低Mfn2可損壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)、松散內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的連接、降低線粒體Ca2+攝取能力［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的聯(lián)系對(duì)于鈣穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)生物合成、線粒體代謝調(diào)節(jié)和凋亡至關(guān)重要。缺失Ras結(jié)合域的Mfn2突變體不能連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，單獨(dú)補(bǔ)充Ras級(jí)聯(lián)信號(hào)分子也不能影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的形態(tài)和相互作用［9］。線粒體分裂是由Drp1介導(dǎo)，線粒體分裂是調(diào)節(jié)線粒體空間形態(tài)的另一個(gè)重要機(jī)制。阻斷線粒體分裂可能導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰、ROS增加、蛋白質(zhì)氧化增加等，線粒體分裂還關(guān)聯(lián)著線粒體的功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等［6］。

對(duì)心力衰竭時(shí)心肌能量代謝改變的認(rèn)識(shí)，不僅有助于了解心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞功能障礙及代償發(fā)生的分子機(jī)制，并為新興的能量代謝治療策略提供了理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

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［2］ Huang P，Yu T，Yoon Y.Mitochondrial clustering induced by overexpression of the mitochondrial fusion protein Mfn2 causes mitochondrial dysfunction and cell death［J］.Eur J Cell Biol，2007，86(6):289-302.

［3］ Shen T，Zheng M，Cao C，et al.Mitofusin-2 is a major determinant of oxidative stress-mediated heart muscle cell apoptosis［J］.J Biol Chem，2007，282(32):23354-23361.

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Altered expression of Mfn2 and Drp1 in surrounding myocardial of rats with acute myocardial infarction

SHI Bing，DONG Lan，YIN Qiusheng，ZHAO Qian，WANG Jun(Department of Gerontology，Beijing Military General Hospital，Beijing 100700，China)

Objective To investigate the altered expression of mfn2 and Drp1 in rats with acute myocardial infarction.Methods The acute myocardial infarction model of 15 male SD Rats were induced by left anterior descending artery ligation，then they were randomly divided into AMI groups(D2，D7，D14).5 male SD rats were shamoperated.The expression of Mfn2 and Drp1 mRNA were detected by real-time PCR.Results Compared to sham group，the expression of Mfn2 and Drp1 of the surrounding tissue decreased in AMI groups，and decreased gradually during the two weeks of post-myocardial infarction.Conclusion The abnormal expression of mitochondrial fusion and fission maybe one of the possible mechanisms of heart failure after AMI.

Myocardial infarction;Genes，mitochondrial;Mitochondria，heart;Cardiovascular physiologic processes;Rats，Sprague-dawley

R542.22

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.021

2011-11-16)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170225)

施冰，博士，E-mail:dr_shibing@bjmu.edu.cn