裴志勇，趙玉生，高偉，尹巧香

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京100700;2.解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所;3.空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科)

·基礎(chǔ)研究·

地黃低聚糖對人脂肪組織來源干細胞旁分泌作用的影響

裴志勇1，趙玉生2，高偉2，尹巧香3

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京100700;2.解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所;3.空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科)

目的 探討地黃低聚糖(RGOs)對分離、培養(yǎng)的人脂肪組織來源干細胞(hASCs)旁分泌作用的影響。方法 酶消化法及貼壁法從人腹部脂肪組織中分離、培養(yǎng)hASCs。流式細胞儀檢測hASCs表面抗原CD29、CD31、CD44、CD45、CD90、CD105、HLA-DR的表達。hASCs經(jīng)RGOs(0.1 g/L)預(yù)處理12 h并繼續(xù)干預(yù)，ELISA法觀察不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，肝細胞生長因子(HGF)，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，基質(zhì)細胞衍生因子-lα(SDF-lα)濃度的變化。結(jié)果

hASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105表達呈陽性，CD31、CD45、HLA-DR表達呈陰性。與對照組相比，RGOs可以促進體外培養(yǎng)的hASCs分泌VEGF、HGF、IGF-1、SDF-1α(P＜0.05)，而對于bFGF的分泌無明顯影響。結(jié)論 RGOs可以增強體外培養(yǎng)的hASCs的旁分泌作用。

地黃;間質(zhì)干細胞;脂肪組織;胞間信號肽類和蛋白質(zhì)類

近年來，隨著人們對間充質(zhì)干細胞的深入研究，發(fā)現(xiàn)其旁分泌功能在組織修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用［1］。學(xué)者們已嘗試運用基因修飾、體外預(yù)處理等策略來加強間充質(zhì)干細胞的旁分泌作用，修復(fù)損傷組織，并且取得了一定效果［2-3］。脂肪組織來源干細胞(ASCs)具有間充質(zhì)干細胞類似的生物學(xué)特性，可以分泌多種生物活性因子。地黃低聚糖(RGOs)是地黃的主要成分之一，具有補血、降血糖、抗腫瘤、增強免疫等藥理活性，而關(guān)于RGOs對ASCs旁分泌作用影響的研究鮮有報道。本研究旨在觀察RGOS對人ASCs(hASCs)旁分泌作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 L-DMED培養(yǎng)基、特級胎牛血清(FBS)、Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶均購自Gibco公司，DispaseⅡ中性蛋白酶購自 Sigma公司，小鼠抗CD31、CD90單克隆抗體均購自BD PharmingenTM公司，小鼠抗CD29、CD45、CD105、HLA-DR單克隆抗體、大鼠抗CD44單克隆抗體均購自Abcam公司，人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，肝細胞生長因子(HGF)，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，基質(zhì)細胞衍生因子-lα(SDF-lα)ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，人bFGF ELISA試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司。RGOs以生地黃為原料加工后經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所提純，高效液相色譜法檢測RGOs提純物中水蘇糖含量為31.15%。主要設(shè)備有:二氧化碳孵箱(美國Thermo scientific公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus BX51)，普通光學(xué)顯微鏡(德國Leica DM IL)，流式細胞儀(美國BD FACS Calibur)，酶標儀(上海Multiscan MK3)。

1.2 方法

1.2.1 hASCs的分離及培養(yǎng) 實驗所用的脂肪組織來源于整形外科腹部吸脂術(shù)后廢棄的脂肪組織液，加入適量消化液(L-DMEM+0.1%Ⅳ型膠原酶+0.1%DispaseⅡ中性蛋白酶+0.1%胰蛋白酶)，置于37℃孵箱振蕩消化40～60 min;加入等量含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，100目、200目篩網(wǎng)過濾，600 g離心6 min;棄上清，加入含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，移入培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，去除懸浮細胞，隨后每2～3天換液1次。1周左右細胞融合80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA溶液消化、傳代。

1.2.2 hASCs的分子表型鑒定 取第4代細胞，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化后PBS重懸細胞并計數(shù)，細胞密度調(diào)至1×106/ml;取8只EP管，分別加入0.5 ml細胞懸液，1000轉(zhuǎn)/min，離心5 min，PBS清洗2遍;0.5 ml PBS再次重懸細胞，加入以下抗體:CD29-FITC、CD31-PE、CD44-FITC、CD45(一抗)、CD90-FITC、CD105-FITC、HLA-DRFITC，對照加入20 μl PBS，混勻后4℃冰箱靜置30 min;1900 r/min，，離心8 min，棄上清;CD45 EP管中的細胞再次用0.5 ml PBS重懸，加入二抗(FITC)，混勻后4℃冰箱靜置30 min，1900 r/min，離心8 min，棄上清;各管均加入2%多聚甲醛0.5 ml，4℃固定30 min。流式細胞儀進行陽性細胞計數(shù)，每次分析獲取2×104個細胞，Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 實驗分組及hASCs培養(yǎng)上清液的留取 取第4代hASCs，以3×105細胞/皿的密度接種于6個50 cm2培養(yǎng)皿中，隨機分為兩組:對照組(n=3)、RGOs組(n=3)。待細胞融合70%～80%時，RGOs組培養(yǎng)基中加入RGOs溶液，終濃度為0.1 g/L。12 h后兩組同時更換培養(yǎng)基，其中對照組更換為無血清L-DMEM培養(yǎng)基，RGOs組更換為含RGOs (0.1 g/L)的無血清L-DMEM培養(yǎng)基。分別于換液后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h時間點吸取細胞上清液，離心后分裝，－70℃保存。每次取上清液后補充同種培養(yǎng)基，保持各皿細胞培養(yǎng)基終體積相同。48 h時間點取上清液后消化各皿細胞并計數(shù)。

1.2.4 ELISA法測定hASCs培養(yǎng)上清液中生長因子濃度 按試劑盒說明書操作步驟測定hASCs培養(yǎng)上清液中各生長因子的濃度。標準品及樣品均采用雙份檢測，酶標儀測定各孔波長450 nm吸光度(OD450)。將TMB(四甲基聯(lián)苯胺)空白顯色孔設(shè)為對照，所有標準品及樣品的OD值減去TMB空白顯色孔的OD值，應(yīng)用Curve Expert 1.3軟件繪制各生長因子標準品曲線，根據(jù)標準曲線計算各樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 hASCs表面抗原表達 第4代hASCs表面抗原表達率如下:CD29(98.87±0.31)%，CD44 (99.78±0.16)%，CD90(98.04±0.19)%，CD105 (99.31±0.48)%，CD31(1.15±0.14)%，CD45 (1.25±0.05)%，HLA-DR(0.98±0.07)%。提示第4代hASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105的表達呈陽性，而CD31、CD45、HLA-DR的表達呈陰性(圖1)。

2.2 RGOs對hASCs生長因子分泌的影響

2.2.1 VEGF、IGF-1 與對照組比較，RGOs組VEGF、IGF-1濃度從3 h開始明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);6 h、12 h、24 h、48 h各時間點以及48 h細胞數(shù)(1×106)校正(48 hr)的VEGF、IGF-1濃度均明顯高于對照組(均P＜0.01)，見表1，2。

2.2.2 HGF、SDF-1α 與對照組比較，RGOs組HGF及 SDF-1α濃度從6 h開始明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，12h、24h、48h各時間點以及48hr的HGF及SDF-1α濃度均明顯高于對照組(均P＜0.01)，見表3，4。

2.2.3 bFGF RGOs組各時間點bFGF濃度與對照組比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液VEGF濃度(±s，ng/L)

表1 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液VEGF濃度(±s，ng/L)

注:與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 48 hr對照組 3 0 0.87±1.4 8.87±4.93 17.80±2.67 35.57±6.16組別 培養(yǎng)皿數(shù)(個) 89.07±13.42 80.73±16.74 RGOs組 3 0.47±0.82 6.6±3.2a22.23±5.91b40.67±4.32b78.80±12.01b412.90±33.67b343.80±41.56b

表2 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液IGF-1濃度(±s，ng/L)

表2 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液IGF-1濃度(±s，ng/L)

注:與對照組比較，aP＜0.01

1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 48 hr對照組 3 25.77±17.93 44.90±8.69 98.93±13.15 220.27±19.09 284.87±21.74 1053.83±51.77 949.53±1組別 培養(yǎng)皿數(shù)(個) 05.2 RGOs組 3 43.63±20.07 122.83±21.87a186.23±58.22a365.17±49.62a747.13±73.51a1606.63±71.73a1374.13±22.54a

表3 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液HGF濃度(±s，ng/L)

表3 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液HGF濃度(±s，ng/L)

與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 48 hr對照組 3 4.88±8.66 14.44±14.23 66.72±14.78 165.27±15.56 252.60±27.63 650.68±78.01 585.53±89.組別 培養(yǎng)皿數(shù)(個) 97 RGOs組 3 6.23±11.11 27.98±12.63 92.20±14.34a237.12±19.13b369.68±24.72b1263.82±51.72b1082.80±75.42b

表4 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液SDF-1α濃度(n=6，±s，ng/L)

表4 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液SDF-1α濃度(n=6，±s，ng/L)

注:與對照組比較，aP＜0.01

1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 48 hr對照組 3 0 20.92±16.00 92.21±22.15 116.43±44.20 198組別 培養(yǎng)皿數(shù)(個).25±26.41 687.67±31.36 618.40±47.71 RGOs組 3 5.23±6.11 51.03±33.02 163.73±50.47a344.55±37.39a425.55±70.50a1135.98±55.63a975.00±99.45a

表5 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液bFGF濃度(n=6，±s，ng/L)

表5 不同時間點hASCs培養(yǎng)上清液bFGF濃度(n=6，±s，ng/L)

1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 48 hr對照組 3 2.55±4.40 10.72±8.21 10.12±9.56 15.31±5.3組別 培養(yǎng)皿數(shù)(個) 5 22.12±7.13 20.42±7.13 18.75±8.29 RGOs組 3 2.90±3.44 5.96±4.82 9.27±8.85 15.48±8.62 18.21±9.90 22.97±9.21 19.52±2.78

3 討論

近年來，許多研究針對干細胞修復(fù)損傷組織的機制進行了探討，但其確切機制仍不十分清楚。既往認為，干細胞主要通過分化成靶組織細胞或與靶組織細胞融合發(fā)揮作用。但干細胞分化，特別是定向分化取決于周圍環(huán)境，迄今為止，干細胞在體內(nèi)是否可以分化為靶組織細胞仍被質(zhì)疑［4-5］。多項研究表明，干細胞植入缺血組織后并未分化成相應(yīng)的靶組織細胞，但卻通過促進新生血管生成、抗凋亡、抗炎和促進增殖等效應(yīng)，明顯改善缺血后心臟、肢體、腎臟和肝臟等器官功能?，F(xiàn)已證實，ASCs能表達、合成、分泌生長因子、細胞因子、調(diào)節(jié)肽等多種生物活性因子，而且不同來源的ASCs所產(chǎn)生的生物活性因子譜相似，這些生物活性因子可以調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、遷移、存活、凋亡、代謝、營養(yǎng)、免疫和組織器官功能［6］。提示干細胞具有強大的旁分泌作用，這不僅直接影響植入干細胞自身的存活和分化，而且還可以調(diào)節(jié)組織內(nèi)其他細胞的功能，后者是干細胞移植發(fā)揮治療效應(yīng)的重要機制之一。因此有學(xué)者提出ASCs可能主要通過旁分泌功能發(fā)揮治療作用。

最近研究表明，干細胞表達、分泌生物活性因子受所處微環(huán)境、生長因子、激素等多種因素調(diào)節(jié)［7］。提示合理干預(yù)干細胞的旁分泌作用可能會更有效促進干細胞修復(fù)損傷組織。然而，目前大量實驗數(shù)據(jù)亦顯示，ASCs分泌各類生物活性因子的量極少，基本上是pg級水平。因此，其通過旁分泌發(fā)揮組織修復(fù)作用的潛力在一定程度上受到受限，故尋求有效的方法(藥物或基因技術(shù))提高ASCs的旁分泌作用成為干細胞研究的新熱點。

體外研究證實，RGOs具有促進動物骨髓干細胞、骨骼肌成肌細胞及 hASCs增殖、分化的功能［8-11］，但關(guān)于RGOs對ASCs旁分泌作用影響的研究鮮有報道。本研究從人腹部吸脂術(shù)后廢棄的脂肪組織中分離、培養(yǎng)了hASCs，流式細胞儀鑒定顯示，第4代hASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105的表達呈陽性，而CD31、CD45、HLA-DR的表達呈陰性。初步證實本實驗分離、培養(yǎng)的hASCs具有間充質(zhì)干細胞的表型。在此基礎(chǔ)上，我們探討了RGOs對體外培養(yǎng)的hASCs旁分泌作用的影響。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的hASCs在RGOs(0.1 g/L)預(yù)處理12 h后，其分泌VEGF、HGF、IGF-1、SDF-1α的作用明顯加強，并且該促分泌作用具有一定時間依賴性，但RGOs預(yù)處理對bFGF分泌無明顯的影響。提示RGOs可以促進hASCs的旁分泌作用，增加部分生長因子的分泌。這對RGOs用于干細胞治療以及探討其作用機制提供了實驗理論依據(jù)。造成以上“選擇性”促旁分泌作用的機制尚不明確。另有研究對RGOs的促旁分泌作用也進行了探討，發(fā)現(xiàn)在(0.1～0.4)g/L濃度范圍內(nèi)，RGOs不但促進hASCs的增殖，而且促進hASCs分泌VEGF，但經(jīng)細胞數(shù)校正后，該促分泌作用與對照組間無明顯差異，該研究認為RGOs的促分泌是促增殖效應(yīng)的間接表現(xiàn)［11］。但該研究測定的樣本是含有小牛血清的培養(yǎng)基，小牛血清中一般均含有多種細胞活性因子，可能含有與所測生長因子相同的成分，故不能準確反應(yīng)hASCs實際的旁分泌作用;另外，該研究僅觀察了hASCs培養(yǎng)3 d時的VEGF水平，沒有觀察RGOs促分泌的時效性。而本研究提取的是無血清細胞培養(yǎng)上清液，排除了血清對生長因子測定結(jié)果的影響;另外，本研究觀察了RGOs預(yù)處理12 h后不同時間點(1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h)細胞培養(yǎng)上清液中生長因子的水平，系統(tǒng)觀察了RGOs作用的時效性;同時，由于無血清培養(yǎng)，RGOs作用時間短，RGOs促增殖效應(yīng)并不明顯;另外本研究還對48 h時間點的生長因子水平進行了細胞數(shù)校正。以上策略能夠較準確反映RGOs實際的促旁分泌作用。

由于本實驗是體外研究，在體情況下RGOs能否同樣促進ASCs分泌多種生物活性因子，從而促進損傷組織的修復(fù)與再生值得進一步研究。

(本文圖1見封三)

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Effect of rehmannia glutinosa oligosaccharides on paracrine action in human adipose tissue-derived stem cells

PEI Zhi-Yong*，ZHAO Yu-Sheng，GAO Wei，YIN Qiao-xiang(*Department of Geriatric Cardiology，Beijing Military General Hospital，Beijing 100700，China)

ObjectiveTo isolate and culture human adipose tissue-derived stem cells(hASCs)in vitro and investigate the effect of Rehmannia glutinosa oligosaccharides(RGOs)on its paracrine action.Methods The isolation and culture of hASCs was conducted by enzyme digestion and adherent from adipose tissue from abdomen.The surface antigens(CD29，CD31，CD44，CD45，CD90，CD105 and HLA-DR)of hASCs were examined by flow cytometry.The levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)，hepatocyte growth factor(HGF)，insulin-like growth factor-1(IGF-1)，basic fibroblast growth factor(bFGF)and stromal cell derived factor-lα(SDF-lα)in the hASCs supernatant were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)after RGOs(0.1 g/L)pretreating for 12 hours.Results The hASCs were identified by positive expression of CD29，CD44，CD90 and CD105，and negative expression of CD31，CD45 and HLA-DR.Campared with control group，the secretion of VEGF，HGF，IGF-1 and SDF-1α in RGOs group was increased significantly(P＜0.05)，but the secretion of bFGF did not increase significantly.Conclusion RGOs could enhance the paracrine action in cultured hASCs in vitro.

Rehmannia glutinosa;Mesenchymal stem cell;Adipose tissue;Intercellular signaling peptides and proteins

R969

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.020

2011-11-12)

國家高科技研究發(fā)展計劃(2006AA02A105)

裴志勇，副主任醫(yī)師，E-mail:peizy6618222@sina.com