張明娟，李薇，龐曉明

1(北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京，100083)

2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

棗果中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的提取工藝及含量測定*

張明娟1，2，李薇1，龐曉明1

1(北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京，100083)

2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

大棗中的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量豐富而且穩(wěn)定，在已測的動植物材料中居首位。試驗采用超聲水浴提取的方法，考察超聲時間、乙醇濃度、料液比3個因素對cAMP提取率的影響，結(jié)果表明料液比為主要影響因素，超聲時間、乙醇濃度次之;確定了cAMP最佳提取工藝:料液比1∶25，乙醇濃度15%，超聲時間20 min。并采用高效液相色譜法測定了8種棗果中的cAMP的含量，最高的為朝陽圓棗(375.61 μg/g)，最低為1-早脆王(46.01 μg/g)。

棗果，環(huán)磷酸腺苷，提取，高效液相色譜法

環(huán)磷酸腺苷(cAMP)分子式為:Cl0H12N5O6P·H2O，水合物為類白色或淡黃色結(jié)晶，微溶于水，不溶于乙醇或乙醚;熔點為219～220℃(分解)，比旋度為-51.3°(C=0.67);它對酸、堿、熱都相當穩(wěn)定[1］。cAMP是人體中的一種重要生物活性物質(zhì)，它是細胞內(nèi)傳遞激素和遞質(zhì)的中介因子，并作為第二信使參與多種生理生化過程的調(diào)節(jié)，對心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮癬等疾病有顯著療效[2，3］。cAMP 和cGMP分別是由Sutherland于1957和Prie于1963年最早從哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)的，其中Sutherland因發(fā)現(xiàn)cAMP于1971年獲得生理和醫(yī)學諾貝爾獎。之后，人們相繼從植物和微生物中發(fā)現(xiàn)了環(huán)腺苷酸，并證明二者是生物界普遍存在的兩種生物活性物質(zhì)[4］。據(jù)文獻報道，棗中cAMP含量在已測動植物中是最高的，是一般動植物的數(shù)千至數(shù)萬倍[5，6］。因而棗中環(huán)磷酸腺苷頗具開發(fā)利用價值。本次試驗對棗中環(huán)磷酸腺苷的提取工藝進行優(yōu)化并采用高效液相色譜對所采集的8種棗果環(huán)磷酸腺苷含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 材料

朝陽圓棗、18-無核棗、1-馬牙棗、1-早脆王、51-1蜂蜜罐、3018小棗、金絲碩豐 、158溆浦雞蛋棗，以上棗果都采自北京林業(yè)大學滄州棗基地。

cAMP標準品(純度98%):日本W(wǎng)AKO公司，甲醇(色譜純):北京化工廠生產(chǎn)，無水乙醇(分析純):北京化工廠生產(chǎn)，磷酸二氫鉀(分析純):北京化學試劑公司生產(chǎn)，蒸餾水。

1.1.2 儀器

島津LC-10A高效液相色譜儀:日本島津制作所，Venusil MP C18色譜柱(4.6×250×5 μm):Agela Technologies，HERAEUS BIOFUGE PRIMO R 冷凍離心機，KQ-500E型超聲清洗器:昆山市超聲儀器有限公司，RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠，HETO POWER DRY LL1500冷凍干燥機，PL403電子天平:梅特勒-托利多儀器有限公司，0.45 μm微孔濾膜，0.45 μm微孔濾頭，1 mL一次性使用無菌注射器，平頭25 μL微量進樣器。

1.2 標準品溶液的制備

精密稱取cAMP標準品5.0mg于50 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻得100μg/mL儲備液。

分別吸取 0.25、0.75、1.25、2.50、3.75 mL 至 25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。得到1、3、5、10、15μg/mL 的標準品溶液。

1.3 樣品溶液的制備

先將8種棗果分別切成片狀，冷凍干燥2 d，用粉碎機磨成粉狀。準確稱取各棗粉1.00 g，用25 mL 15%乙醇溶解，超聲提取20 min，然后放入80℃[7］的水浴中振蕩提取4 h，以3000 r/min冷凍離心5min，取上清液置入100 mL濃縮瓶中。殘渣再加10 mL 15%乙醇溶解，80℃的水浴中振蕩20 min后3000 r/min冷凍離心5 min，所得上清液合并入上述濃縮瓶中。將上清液真空濃縮后轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，用高效液相色譜法進行測定[8］。

1.4 色譜檢測條件

色譜柱:Venusil MP C18(4.6×250×5 μm)，流動相:甲醇與20mmol/L磷酸二氫鉀(體積比20∶80)，流速:1 mL/min，溫度:室溫，檢測波長:254 nm，進樣量:15 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

環(huán)磷酸腺苷標準品色譜圖如圖1，標準曲線圖如圖2。

圖1 標準品的高效液相色譜圖(15μg/mL)

圖2 標準曲線圖

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 料液比對朝陽圓棗中cAMP提取率的影響

在超聲時間15 min，乙醇濃度15%的條件下，選取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶255個料液比水平研究對cAMP提取率的影響[8］，見圖3。

從圖3可知，隨著料液比的增加，提取率增加，1∶10之后提取率趨于平緩。因此可選出用于正交實驗中的料液比的3 個水平為1∶15，1∶20，1∶25。

2.2.2 乙醇濃度對朝陽圓棗中cAMP提取率的影響

在料液比1∶15，超聲時間15 min的條件下，選取乙醇濃度10%、15%、20%、50%、80%5個料液比水平研究對cAMP提取率的影響，見圖4。

圖3 料液比對cAMP提取率的影響

圖4 乙醇濃度對cAMP提取率的影響

從圖4可知，隨著乙醇濃度的增大，提取率增大，在15%時達到最大值，之后隨濃度的增大提取率降低，這可能和cAMP在乙醇中的溶解性有關(guān)。因此可選出用于正交實驗的乙醇濃度的3個水平為10%，15%，20%。

2.2.3 超聲時間對朝陽圓棗中cAMP提取率的影響

在料液比1∶15，乙醇濃度15%的條件下，選取超聲時間 5、10、15、20、25min 五個料液比水平研究對cAMP提取率的影響，見圖5。

圖5 超聲時間對cAMP提取率的影響

從圖5可知，隨著超聲時間的延長，提取率增加，在15 min時達到最大值，之后隨時間的延長提取率降低，可能是超聲時間過長，細胞中其他物質(zhì)溶出，影響cAMP的提取。因此可選出用于正交實驗的超聲時間的3 個水平為10，15，20 min。

2.2.4 正交試驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、料液比、超聲時間進行3因素3水平正交試驗，按L9(34)正交表安排試驗，重復2次。試驗結(jié)果見表1。

表1 正交實驗結(jié)果及極差分析

由極差分析可以得出A因素對提取效果影響最大，其次是C、B因素，即各因素作用影響順序為:料液比＞超聲時間＞乙醇濃度。提取棗中cAMP的最優(yōu)的水平組合為A3B2C3，即料液比1∶25，乙醇濃度15%，超聲時間20 min。

2.2.5 優(yōu)化方案的確定

取正交實驗最優(yōu)組合A3B2C3與表1中提取率最高的組合A3B2C1進行驗證試驗，正交實驗最優(yōu)組合A3B2C3得到的朝陽圓棗 cAMP為375.61μg/g，而表1中提取率最高的組合A3B2C1得到的朝陽圓棗cAMP為361.11 μg/g，因此以正交實驗最優(yōu)組合A3B2C3為最優(yōu)提取條件。

2.3 八種棗果中cAMP含量

應用高效液相色譜測定八種棗果中的cAMP的含量，結(jié)果見表2和圖6。

表2 8種棗果cAMP含量

圖6 8種棗果cAMP含量比較

由圖6可知，所測定的不同品種棗中cAMP含量差異很大，最高為朝陽圓棗(375.61 μg/g)，最低為1-早脆王(46.01 μg/g)。

3 結(jié)論

試驗可知超聲時間、乙醇濃度、料液比對cAMP的提取有不同的影響，各因素作用主次順序為:料液比＞超聲時間＞乙醇濃度。棗中cAMP提取的最優(yōu)條件為料液比1∶25，乙醇濃度15%，超聲時間20 min，在此條件下朝陽圓棗的cAMP含量為375.61 μg/g。

試驗中所測定的8個不同品種的棗以前均無文獻報道，本文首次測定了該8個品種棗的cAMP含量。試驗結(jié)果為cAMP含量最高的是朝陽圓棗(375.61 μg/g)，最低是1-早脆王(46.01 μg/g)，由此說明棗的不同品種間cAMP含量的差異很大。

cAMP是一種重要的生理活性物質(zhì)，對人體健康起著重要的作用，而在本實驗已測的8種棗中，朝陽圓棗中cAMP的含量顯著高于其他棗，因此在生產(chǎn)棗類制品時，可優(yōu)先使用此類棗，以使其制品具有更高的營養(yǎng)價值和商業(yè)價值。

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ABSTRACTThe cAMP content is abundant and stable in jujubes，and is the highest in animals and plants tested so far.This paper used the method of ultrasound and water bath extraction to study the effect of three factors(time of ultrasound，concentration of alcohol，solid-liquid ratio)on the extraction rate of cAMP.The result showed that solid-liquid ratio was the main influencing factor，ultrasonic time，concentration of alcohol was then followed.The best extraction process of cAMP was:solid-liquid ratio 1∶25，solvent concentration15%，ultrasonic time 20min.The paper also used high performance liquid chromatographic to determine cAMP content in eight kinds jujubes，and it showed that chaoyangyuanzao had the highest(375.61μg/g)content，1-zaocuiwang had the lowest(46.01μg/g)content.

Key wordsjujubes，cAMP，extraction，HPLC

Study on Extraction cAMP from Jujubes and Its Quantitative Determination

Zhang Ming-juan1，2，LI Wei1，Pang Xiao-ming1，Wang Feng-juan1
1(Couege of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry Universty，Beijing 100083，China)
2(China National Research institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027，China)

碩士研究生(王豐俊副教授為通訊作者;E-mail:010100083@163.com)。

*中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(JD2010-5)，林業(yè)公益性行業(yè)科研專項“棗新品種選育和產(chǎn)業(yè)升級關(guān)鍵技術(shù)研究”(201004017)資助

2011-0-，改回日期:2011-0-