黃芳，周宏，陳華，扶慶權

1(南京曉莊學院 生物化工與環(huán)境工程學院，江蘇 南京，211171)

2(重慶大學 化學化工學院，重慶，400030)

橘皮中橙皮苷提取的優(yōu)化及其對羥自由基清除作用*

黃芳1，周宏1，陳華2，扶慶權1

1(南京曉莊學院 生物化工與環(huán)境工程學院，江蘇 南京，211171)

2(重慶大學 化學化工學院，重慶，400030)

通過單因素試驗分析了乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度和提取時間對橙皮苷得率的影響，在此基礎上選擇4因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗設計，采用響應面法對橘皮中橙皮苷的提取工藝進行了優(yōu)化。結果表明:最佳提取工藝條件為溶劑中乙醇體積分數(shù)71﹪，液料比22∶1 mL/g，提取溫度70℃，提取時間2.5 h。經(jīng)試驗驗證，在此條件下，得率達4.82%。對橙皮苷提取液的抗氧化研究表明，橙皮苷對羥自由基有一定的清除作用。

響應曲面，橙皮苷，提取工藝，羥自由基

橙皮苷是一種廣泛存在于柑橘類水果中的類黃酮物質，尤其是在柑、橘、橙和檸檬等的果皮中含量較高。藥理研究表明，橙皮苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、維持血管正常滲透壓、增強毛細血管韌性、保護心血管等多種功效，在臨床上用于心血管系統(tǒng)疾病的輔助治療，也用于醫(yī)藥工業(yè)中制藥的原料[1］。此外，橙皮苷可在食品工業(yè)中可用作天然抗氧化劑，也可用于化妝品行業(yè)，其逐漸成為食品添加劑、日用化工業(yè)關注的熱點。

橙皮苷常用的提取方法有熱水提取法、溶劑提取法[2］、堿提酸析法[3］、超聲波提取法[4］、微波提取法[5］和酶解法[6］等。其中，熱水提取法、溶劑提取法和酸提堿析法簡單易操作，是傳統(tǒng)的提取方法。傳統(tǒng)的橙皮苷提取工藝各有優(yōu)缺點:如熱水提取法工藝簡單，但產(chǎn)物雜質多，收率低。堿浸酸析法需大量使用酸堿，會產(chǎn)生鹵鹽等副產(chǎn)物。醇溶劑提取得到橙皮苷的純度較高，有機溶劑可以回收，且不使用大量的酸或堿，有利于環(huán)境保護。有文獻報道[3］，用甲醇提取橙皮苷效率較高，但甲醇毒性較大，只適合實驗室使用，而乙醇毒性小、使用安全，不僅實驗室可以使用，而且適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。采用響應面法優(yōu)化乙醇提取橙皮苷的提取工藝尚未見報道。本研究在乙醇提取法單因素試驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化橘皮中橙皮苷的提取工藝，并評價優(yōu)化條件下提取物對羥自由基的清除作用，以其為橙皮苷的工業(yè)化生產(chǎn)和進一步開發(fā)利用提供科學參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

722N型分光光度計，上海第三分析儀器廠;AUY120電子天平，日本島津;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;101A-2型電熱鼓風干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司。

橘皮(市售)于40℃烘箱中烘干，粉碎，過60目篩，裝瓶備用。

甲醇:99.5%;雙氧水30%:;硝酸鋁99%;硫酸亞鐵溶液(3.0 mmol/L);水楊酸-乙醇溶液(3.0 mmol/L);無水乙醇。橙皮苷標準品:購于中國藥品生物制品檢定所。以上試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

準確稱取橙皮苷標準品5 mg，甲醇充分溶解并定容于50mL容量瓶中，得到橙皮苷標準儲備液。分別準確吸取橙皮苷儲備液 0.50、1.00、1.50、2.00、2.05、3.00、3.50、4.00 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加入1.00 mL 5%的Al(NO3)3溶液，于80℃水浴中加熱15 min后，冷卻后定容至刻度。橙皮苷與 Al(NO3)3能形成黃色絡合物，其最大吸收波長為390 nm，見圖1。以試劑作空白，依次測定各溶液的吸光度，可得吸光度A與橙皮苷濃度c(μg/mL)的標準曲線回歸方程為:A=0.003c+0.008，相關系數(shù) R2=0.9990，見圖2。試驗表明，橙皮苷在5～40 μg/mL的濃度范圍內有良好的線性關系。

圖1 橙皮苷-Al絡合物的吸收曲線

圖2 橙皮苷的標準曲線

1.2.2 供試品溶液的制備和測定

準確稱取5 g橘皮粉末，加入一定濃度的乙醇，回流提取。過濾后冷卻，置250 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻得提取液。精密移取一定體積提取液，置于10 mL容量瓶中，加入1.00 mL 5%的Al(NO3)3溶液，于80℃水浴中加熱15 min后，冷卻后定容至刻度，待測。由于橙皮苷樣品未經(jīng)脫色，本身含有雜質黃，在測定時設置試劑空白做對照，用總的吸光度值減去非黃酮類物質在390 nm下的吸光度值[7］。根據(jù)所得吸光度代入標準曲線方程，計算橙皮苷的含量及得率:

1.2.3 單因素試驗

為確定橙皮苷的提取工藝，取定量橘皮，研究乙醇體積分數(shù)(50%～100%)、液料比(5∶1～30∶1 mL/g)、提取溫度(40～90℃)及提取時間(1～3.5 h)4個因素對橙皮苷得率的影響，以確定優(yōu)化設計參數(shù)范圍。

1.2.4 響應面試驗設計

基于單因素試驗結果，以乙醇體積分數(shù)(X1)、液料比(X2)，提取溫度(X3)、提取時間(X4)為考察因素，以橙皮苷的得率為響應值，采用4因素3水平的Box-Behnken Design(BBD)試驗設計，優(yōu)化提取條件。

1.2.5 橙皮苷清除羥自由基的研究

參照文獻[8］采用Fenton反應體系產(chǎn)生羥自由基模型。在反應體系中，H2O2與Fe2+混合反應產(chǎn)生·OH，但由于·OH具有很高的反應活性，存活時間短，若在反應體系中加入水楊酸，就能有效的捕捉·OH，并產(chǎn)生有色物質，該產(chǎn)物在510 nm處有強吸收。若在此反應體系中加入有清除·OH功能的被測物，便會與水楊酸競爭，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。

清除率/%=[A0-(AX-AX0)］/A0×100

式中:A0為空白對照液的吸光度;AX為加入被測物后的吸光度;AX0為不加H2O2的吸光度。

方法:在25 mL比色管中依次加入3.0 mmol/L FeSO4溶液2mL，3.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL，2.5 mmol/L H2O22 mL，搖勻，蒸餾水定容至刻度，于37℃水浴中反應30 min，于510 nm處測定吸光度A0，在上述體系中不加H2O2的溶液測定得到AX0，分別加入不同體積的橙皮苷提取液測定吸光度為AX，所有溶液均以蒸餾水為參比。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)的影響

由圖3所示，隨著乙醇體積分數(shù)增大橙皮苷得率會逐漸增加，當乙醇體積分數(shù)為70%時得率最高，為4.79%。再繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)時橙皮苷得率反而會降低，其原因可能是乙醇體積分數(shù)高，溶液所含的水分減少，不能充分浸入到橘皮里，導致得率下降[9］。因此選擇乙醇體積分數(shù)為70%作后續(xù)試驗繼續(xù)考察。

圖3 乙醇濃度對得率的影響

2.1.2 不同液料比的影響

由圖4可知，在液料比達到20∶1 mL/g前，橙皮苷得率隨著提取液用量的增加而增加。料液比為20∶1 mL/g時，得率最大達4.73%。但再增加液料比，得率反而下降，這是因為溶劑用量達到一定程度時橘皮中橙皮苷已基本全部溶出，再增加溶劑的用量不僅增加成本，還會給后續(xù)的處理增加困難。因此選擇液料比為20∶1 mL/g。

圖4 液料比對得率的影響

2.1.3 提取溫度的影響

溫度越高，分子運動加速，溶劑提取效率越高。由圖5可知，隨著提取溫度的增加，橙皮苷溶解度增大，得率增加，70℃時得率達4.77%。但溫度高于70℃后得率呈下降趨勢?？赡苁怯捎跍囟雀叨鴮е缕渌M分的溶解從而抑制了橙皮苷的溶出，同時高溫也可能導致橙皮苷的結構被破壞。因此，試驗選擇為70℃為最佳的提取溫度。

圖5 提取溫度對得率的影響

2.1.4 提取時間的影響

如圖6所示，得率隨著提取時間的增加而增加。當提取時間為2.5 h時，得率達4.62%。但提取時間超過2.5 h后，得率呈現(xiàn)下降趨勢。提取時間較短時，橙皮苷來不及溶出，時間太長則可能會因為橙皮苷因長時間受熱使結構發(fā)生變化，且隨著提取時間的增加干擾成分的溶出量也隨之增加，導致提取量下降。故試驗選擇提取提取時間為2.5 h。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 橙皮苷提取工藝回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗基礎上，進行4因素3水平的Box-Behnken Design(BBD)試驗設計優(yōu)化提取條件，試驗因素水平及編碼見表1。自變量的編碼值1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平。選取了4因素3水平共29個試驗點(5個中心點)的響應面分析試驗，試驗設計表格及試驗結果見表2，回歸模型的方差分析見表3。

圖6 提取時間對得率的影響

表1 響應曲面設計試驗因素水平和編碼

表2 響應曲面試驗設計及結果

表3 回歸模型的方差分析

對表2試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到橙皮苷的得率對以上4個因素的二次多項回歸模型為:

式中:Y為橘皮中橙皮苷的得率的預測值;X1、X2、X3、X4分別代表乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間的編碼值。表3方差結果顯示，方程復相關系數(shù)的平方R2為0.9830，說明該模型極顯著(P＜0.01);為0.9661，說明建立的模型能夠解釋96.61%響應值的變化，能很好地描述橘皮中橙皮苷提取過程的得率隨提取條件的變化規(guī)律。因此，該方程擬合情況合理可靠。從回歸方程各項方差檢驗可以看出，方程的二次項的影響均極顯著，交互影響顯著，各一次項顯著性參差不齊，表明各影響因素對橙皮苷得率的影響不是簡單的線性關系，所以可以利用回歸方程來確定最佳提取工藝條件。

圖7 乙醇濃度(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)和提取溫度(X4)對橙皮苷得率影響的響應面圖

2.2.2 響應曲面分析與優(yōu)化

各因素及其交互作用對響應值的影響結果可通過響應面分析圖形象地看出來。特征值均為正值時，響應面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在;當特征值為負值時，為山丘曲面，有極大值存在;當特征值有正有負時，為馬鞍形曲面，無極值存在[10］。從圖7各因素間的響應曲面圖可以看出，各圖均為山丘曲面，即得率Y隨著任意2個編碼值的增加呈先升高后降低的趨勢，說明各交互因子均有一個最佳編碼組合使得率Y達到最高。

為了進一步確證最佳點的取值，對回歸方程取一階偏導數(shù)并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即4個主要因素的最佳水平值，轉換整理得到橙皮苷提取的最佳條件為乙醇體積分數(shù)70.7%，液料比為21.35 mL/g，提取溫度為69.4℃，提取時間為2.48 h，在此條件下橙皮苷得率理論值可達4.86%。為檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進行橙皮苷的提取，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為乙醇體積分數(shù)71.0%，液料比為22∶1 mL/g，提取溫度為70℃，提取時間為2.5 h，實際測得橘皮中橙皮苷的得率為4.82%，與理論預測值比較相對誤差為0.82%，說明該模型可以較好地預測橘皮中橙皮苷的提取條件與橘皮中橙皮苷的得率之間的關系，具有一定的實用價值。

2.3 橘皮中橙皮苷清除羥自由基的研究

不同濃度的橙皮苷提取液對·OH的清除結果見圖8。試驗表明，橙皮苷提取液對·OH有明顯的清除作用。隨著橙皮苷濃度的增加，對·OH的清除能力也逐漸增強，且二者間具有較好的相關性，回歸方程Y=6.13X-11.801(R2=0.9778)。橙皮苷提取液對·OH的半清除率IC50=10.08 μg·mL，表明橙皮苷具有較強的抗氧化能力。

圖8 橙皮苷提取液對羥自由基的清除率

3 結論

本文應用試驗設計軟件Design-Expert7.0，采用響應面設計中的Box-Behnken設計，利用模型的響應面及等高線對橘皮中橙皮苷提取工藝中的4個提取條件的相互作用進行了探討，確定了最佳水平范圍，優(yōu)化出最優(yōu)工藝條件為:以體積分數(shù)為71%的乙醇為提取溶劑，液料比22∶1 mL/g，在70℃下反應2.5 h，在此條件下橙皮苷的得率達4.82%。此外，橙皮苷提取液對羥自由基的清除作用說明，橙皮苷具有良好的抗氧化能力。

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ABSTRACTFour factors including ethanol concentration，solvent to material ratio，extraction temperature and extraction time were studies on the yield of hesperidin from the citrus peel by using single factor analysis method.Then a four factor，three-level Box-Behnken central composite design(CCD)coupled with response surface analysis(RSM)was applied in optimization of the extraction.It was found that the optimum extraction conditions were:ethanol concentration 71%，solvent to material ratio 22∶1(mL/g)，extraction temperature 70℃ and extraction time 2.5 h.Under the optimized extraction conditions，hesperidin extraction yield was 4.82%.The research on anti-oxidation properties showed that the extracted hesperidin had scavenging activity on free hydroxyl radical.

Key wordsresponse surface methodology，hesperidin，extraction technological conditions，hydroxyl free radical

Optimization of Total Hesperidin Extraction from Citrus Peel by Response Surface Methodology and Its Scavenging Activity on Free Hydroxyl Radial

Huang Fang1，Zhou Hong，Chen Hua2，F(xiàn)u Qing-quan1
1(College of Biochemical Engineering and Environmental Engineering，Nanjin XiaoZhuang University，Nanjing 211171，China)
2(College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400030，China)

碩士研究生，講師。

*國家自然科學基金(21171097);重慶市自然科學基金(2010BB0063)資助

2011-10-08，改回日期:2012-03-09