張沖，劉祥，陳計巒

1(國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(天津)，天津，300384)

2(新疆石河子大學食品學院，新疆 石河子，832000)

實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)檢測活的金黃色葡萄球菌*

張沖1，2，劉祥1，，陳計巒2

1(國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(天津)，天津，300384)

2(新疆石河子大學食品學院，新疆 石河子，832000)

針對基于DNA水平的聚合酶鏈式反應(yīng)(DNA-PCR)檢測食品中金黃色葡萄球菌時會出現(xiàn)假陽性結(jié)果的缺點，建立一種能夠區(qū)分死、活金黃色葡萄球菌的檢測方法。根據(jù)金黃色葡萄球菌的femA基因，自設(shè)計Taqman探針、引物，采用一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)，以femA mRNA為檢測對象，發(fā)現(xiàn)只有活的金黃色葡萄球菌顯陽性，死亡的則呈陰性;純培養(yǎng)時，重復檢測變異系數(shù)為0.15，靈敏度為9×102CFU/mL，檢出限可達1/3 CFU/3 mL。實驗表明，該研究所建立的一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)檢測法，不僅靈敏度高、特異性強，而且能夠有效地區(qū)分死、活金黃色葡萄球菌。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)，金黃色葡萄球菌，死活菌，普通聚合酶鏈式反應(yīng)

金黃色葡萄球菌是引起細菌性食物中毒的重要病原菌之一[1-3］，據(jù)美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希菌，居第2位，占細菌性食物中毒的33%[4］;大約有10%～40%的人是該病原菌的攜帶者[5］，約32%的食品中存有該菌，由此引起的食物中毒極為普遍[6］。因此，對金黃色葡萄球菌的實時監(jiān)測尤為重要。

目前，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time PCR)已被認為是檢測金黃色葡萄球菌的最可靠、高效、低耗費的方法[7］，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快等優(yōu)點[8-9］。但國內(nèi)外當前運用最多的實時 PCR法，大都是基于 DNA水平(DNA-PCR)，雖然快速、靈敏，但由于細菌死亡后，DNA降解緩慢，能夠穩(wěn)定存在，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果[10］，無法區(qū)分死、活細菌。與DNA相比，mRNA的穩(wěn)定性較差，在細菌死亡后能夠快速降解[11］，而在細菌還具有活性時，就會產(chǎn)生mRNA。因此，選擇恰當?shù)膍RNA作為靶點基因，運用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，便能夠只檢測到具有活性的細菌，避免死亡細菌假陽性的出現(xiàn)[12］

femA是金黃色葡萄球菌細胞壁合成的必備基因，其編碼蛋白與細胞壁肽聚糖五甘氨酸橋合成有關(guān)，同時也是當前最重要的病原菌——耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)表達耐藥特性的重要輔助基因[13-15］。目前，RT-PCR 已被成功地應(yīng)用到金黃色葡萄球菌 gryB、hlgA、hlgB、hlgC、lukF、luk S、luk E、luk M、spa、seA、seB、seB、seD等基因的檢測，均表現(xiàn)出較高的特異性與靈敏度[16-17］。由此，本研究選擇金黃色葡萄球菌的特異性femA基因，自設(shè)計TaqMan探針和引物，采用一步法RT-PCR技術(shù)，擬建立一種能夠區(qū)分死、活金黃色葡萄球菌的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、大腸桿菌(O157:H7)[E.coli(O157:H7)］、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、沙門氏菌(Salmonella)。上海之江生物科技Bio-Rad PCR儀，配有CFX96TMReal-Time System與C1000TMThermal Cycler，美國Bio-Rad公司;RNAprep pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒，北京天根生化公司;PCR反應(yīng)試劑，Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)Real Time PCR Kit上海之江生物科技;DNase I、RNase-free，美國Fermentas公司;以上試劑均為分析純試劑。

1.2 引物與探針

本實驗所用的引物與探針如表1所示。

表1 實驗所用的引物與探針

1.3 實驗方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)

將活化后的菌液50 μL接種于3 mL LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)3h，200 r/min，37℃。

1.3.2 DNA與RNA提取

分別按提取試劑盒說明書進行。

1.3.3 DNase I消化

按DNase I說明書進行。

1.3.4 一步法RT-PCR擴增體系

擴增體系共 40 μL，其中包括 10× Buffer4μL，MgCl23.2 μL，dNTP 0.8 μL，femA-f 0.5 μL，femA-r 0.5 μL，femA-p 0.1 μL，混合酶1μL，ddH2O 25.9 μL，RNA 提取液4 μL。

擴增參數(shù)為:45℃×10 min;95℃×15 min;94℃×20 s，55℃×20 s，72℃×30 s，40cycles;單點熒光在72℃;選用FAM通道檢測。

1.3.5 DNA-PCR擴增體系

1.3.5.1 試劑盒法

擴增體系共40 μL，金黃色葡萄球菌熒光定量檢測混合液 35.6 μL，Taq 酶 0.4 μL，DNA 提取液4μL。

擴增參數(shù)為:94℃×2 min;93℃×15 s，60℃×60 s，40cycles;單點熒光在60℃;選用HEX通道檢測。

1.3.5.2 femA及gB探針法

擴增體系共 40 μL，其中包括 10× Buffer4μL，MgCl23.2 μL，dNTP 0.8 μL，femA-f/gB-f 0.5 μL，femA-r/gB-r 0.5 μL，femA-p/gB-p 0.1 μL，Taq 酶0.4 μL，ddH2O 26.5 μL，DNA 提取液4μL。

擴增參數(shù)為:95℃×3 min;94℃×20 s，55℃×20 s，72℃×30 s，40 cycles;單點熒光在 72℃;選用 FAM通道檢測。

1.3.6 區(qū)分死活菌

吸取2管100 μL活化后的金黃色葡萄球菌液，一管設(shè)為活菌，不做任何處理;另一管設(shè)為死菌，80℃水浴 20 min[11，18］。提取后，采用一步法 RT-PCR 檢測。

同時另取2管相同濃度的死、活菌直接提取DNA，然后采用常規(guī)熒光PCR(DNA-PCR)的方法檢測。

比較2組擴增結(jié)果，若DNA-PCR擴增后活菌與死菌均為陽性，而RT-PCR擴增后活菌結(jié)果為陽性，死菌為陰性，則說明能夠區(qū)分死活菌。

1.3.7 特異性檢測

取上述菌種與金黃色葡萄球菌同時抽提RNA后，再進行femA RT-PCR檢測，驗證體系的特異性。若只有金黃色葡萄出現(xiàn)陽性結(jié)果，而其它致病菌顯陰性，則說明該引物與探針具有良好的特異性。

1.3.8 重復性

分別取體積為 500 μL、100 μL、10 μL、1 μL 的菌液進行RNA抽提，然后采用RT-PCR擴增，每個體積重復6次。根據(jù)統(tǒng)計學原理，將每個體積所得數(shù)據(jù)相對標準偏差作為變異系數(shù)(CV)，再求其平均值，若平均值小于0.5%，則重復性良好。

1.3.9 標準曲線制作

取1 mL活化后的金黃色葡萄球菌，然后按步驟提取RNA，將提取液先按10倍比例稀釋，在稀釋至10-3后，按5倍比例稀釋至 10-6∶100、10-1、10-2、10-3、10-3/5、10-4、10-4/5、10-5、10-5/5、10-6，再進行RT-PCR擴增繪制標準曲線，并將定量結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比對。

1.3.10 檢出限

在3 mL培養(yǎng)基中分別加入菌量100 CFU、10 CFU、1 CFU、1/3 CFU、1/5 CFU、1/10 CFU，200 r/min，37℃，增菌3 h后，RT-PCR擴增，觀察其擴增曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 區(qū)分死活菌

圖1 活菌與死菌的擴增曲線圖

活菌與死菌經(jīng)過不同方式擴增后的結(jié)果見圖1。由于金黃色葡萄球菌死亡以后，femA DNA降解緩慢，所以DNA-PCR擴增時死菌、活菌均出現(xiàn)峰值，如圖1-A所示;而femA mRNA穩(wěn)定性較差，在金黃色葡萄球菌死亡后迅速降解，所以經(jīng)過RT-PCR擴增后，活菌擴增曲線出現(xiàn)峰值，死菌的擴增曲線未出現(xiàn)峰值，如圖1-B所示。數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)RT-PCR擴增后，活菌的Ct值為31.38，呈陽性，死菌未檢出，為陰性;而另一組經(jīng) DNA-PCR擴增后，活菌的 Ct值為20.27，死菌為20.83，兩者均呈陽性。由此說明，本實驗所建立的RT-PCR具有區(qū)分死、活細菌的能力，能夠避免死菌假陽性的出現(xiàn)。

2.2 特異性

將其它菌種與金黃色葡萄球菌同時抽提RNA后，經(jīng)RT-PCR擴增，結(jié)果顯示，除金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果為陽性外，其它致病菌菌的檢測結(jié)果均為陰性。由此可見，本實驗所用的femA引物與探針具有較高的特異性，能夠避免其它致病菌的干擾。

圖2 特異性擴增曲線

2.3 重復性

取4組不同體積的菌液，重復檢測6次，結(jié)果見表2，4組體積的平均變異系數(shù)分別為0.18、0.12、0.15、0.13，平均變異系數(shù)為 0.15，小于 0.5，由此可以看出，該方法具有良好的重復性。

表2 RT-PCR檢測結(jié)果

2.4 標準曲線

稀釋后的樣品經(jīng)RT-PCR擴曾后，濃度在4.5×106、4.5×105、4.5×104、4.5×103、9×102的樣品可形成較為理想擴增曲線，如圖3-A，所以本方法的靈敏度為9×102CFU/mL。以Ct值為縱坐標，對數(shù)濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如圖3-B。經(jīng)對比，RT-PCR活菌定量結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)果吻合率為100%。

2.5 檢出限

增菌3 h后，100 CFU、10 CFU、1 CFU、1/3 CFU、1/5 CFU、1/10 CFU RT-PCR擴增曲線如圖4所示，100 CFU、10 CFU、1 CFU、1/3 CFU 呈陽性，其它均為陰性。因此，在純培養(yǎng)時，該方法的最低檢出限為1/3 CFU/3 mL。

3 討論

3.1 陽性樣本判定

本實驗所建立的RT-PCR法，活菌顯陽性，死菌呈陰性，即有擴增曲線出現(xiàn)的為金黃色葡萄球菌陽性樣本，未出現(xiàn)擴增曲線的為金黃色葡萄球菌陰性樣本。但由于細菌死亡后，DNA能夠穩(wěn)定存在，若消化不徹底，RT-PCR檢測時仍然會出現(xiàn)死菌為陽性的結(jié)果，會嚴重影響檢測結(jié)果的判定，如圖5所示。因此，徹底消化抽提液中的殘留DNA是區(qū)分死、活菌的關(guān)鍵。

圖3 金黃色葡萄球菌標準曲線

圖4 RT-PCR檢出限擴增曲線

已有研究表明，Ct值相差在3.1～3.6時，同一體系中，其濃度大約有10倍左右的差異。同一樣本抽提液在不徹底消化時，經(jīng)過RT-PCR與DNA-PCR擴增后，在Ct值上會形成一定的差異。因此，除上述判定方法外，還可以采用RT-PCR與DNA-PCR檢測結(jié)果的差值(ΔCt)來判定是否為陽性樣本[19］。

圖5 未完全消化的RT-PCR擴增曲線

若同一樣本RT-PCR的擴增Ct值與PCR的擴增Ct值相差大于4，則該樣本為金黃色葡萄球菌陽性;若二者的Ct差值小于4，那么使用DNase I再消化1次，如果再次消化后，二者的Ct差值≥4，那么該樣本為金黃色葡萄球菌陽性，反之則為金黃色葡萄球菌陰性。例如，3組樣本經(jīng)RT-PCR與DNA-PCR的擴增后，ΔCt分別為5.99、2.51、6.78，如表2，由于樣本 1、3的ΔCt均大于4，樣本2的ΔCt＜4，那么可判定樣本1、3為陽性;再取樣本2，經(jīng)二次消化后擴增，其ΔCt為0.04，如表3，由于二次消化后 ΔCt＜4，那么樣本2為陰性。由此，3組樣本的最終判定結(jié)果為:1、3號樣本為金黃色葡萄球菌陽性樣本，2為金黃色葡萄球菌陰性樣本，如表4所示。

表2 RT-PCR與DNA-PCR擴增結(jié)果

表3 再次消化后的擴增結(jié)果

表43組樣本判定結(jié)果

3.2 引物與探針

就大多數(shù)實時PCR法而言，引物、探針的序列和質(zhì)量[20］是影響檢測結(jié)果的重要因素。本實驗以市售的熒光PCR檢測試劑盒為標準，采用femA與gB引物、探針，對同一樣本進行多次DNA-PCR檢測，結(jié)果如表5所示。取前5個梯度的(107～103)3次檢測Ct平均值為橫縱坐標，數(shù)量級的對數(shù)值為橫坐標，得到3條標準曲線，試劑盒:y=-3.356x+44.19，R2=0.998;femA:y=-3.147x+42.83，R2=0.995;gB:y=-3.362x+45.79，R2=0.987，如圖7所示。若忽略實驗操作誤差的影響，將試劑盒的檢測結(jié)果作為絕對準確定量，那么femA檢測結(jié)果的R2=0.995×(1/0.998)=0.997，gB的 R2=0.987×(1/0.998)=0.989。

表3 不同的引物與探針檢測結(jié)果

圖6 試劑盒、femA、gB標準曲線

在采用RT-PCR對活菌的mRNA檢測時，femA引物、探針能夠區(qū)分死、活金黃色葡萄球菌，具有較高特異性及靈敏度(前文所示)，而gB引物、探針幾乎無法形成較完整的擴增曲線(結(jié)果未列出)，難以區(qū)分死、活金黃色葡萄球菌。因此，合理的選擇靶基因，篩選高效的引物、探針，是一個至關(guān)重要的過程，不同的引物與探針，對實驗結(jié)果會有很大的影響[7-9，16-17］。同時，結(jié)果也說明，gB 引物、探針的準確性較差(R2＜0.99)，只適用于陽性樣本的DNA檢測，不適用于樣本的準確定量，也無法用于活菌的mRNA檢測;而本研究自設(shè)計的femA引物、探針在DNA定量準確性上面已經(jīng)接近市售標準試劑盒水平，且在靈敏度上已優(yōu)于市售試劑盒。

目前，實時PCR已經(jīng)被認為是檢測金黃色葡萄球菌最為高效、準確的方法[21］，但由于基于DNA水平的常規(guī)PCR無法區(qū)分死、活菌，使其應(yīng)用受到極大地限制。本研究以金黃色葡萄球菌femA基因為靶基因，選取其保守區(qū)域設(shè)計一對Taqman探針、引物，建立一了套基于RNA水平的PCR檢測方法(RTPCR)，不僅特異性強、靈敏度高，檢出限可達1/3CFU/3 mL，而且能夠有效的區(qū)分死、活金黃色葡萄球菌，具有較強的實際應(yīng)用價值。同時，本文所采用的實時RT-PCR技術(shù)不僅能有效的區(qū)分死、活菌，而且還能夠檢測到處于活的非培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC)下的細菌，其檢測結(jié)果可作為菌體活性評估的重要參照[22］，是活菌檢測的“金”標準[23］，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。

[1]Laupland KB，Gregson DB，Zygun DA，et al.Severe bloodstream infections:a population-based assessment[J］.Crit Care Med，2004，32:992-997.

[2]Sharma M，Berriel-Cass D，Baran J Jr.Sternal surgical site infection following coronary artery bypass graft:prevalence，microbiology，and complications during a 42-month period[J］.Infect Control Hosp Epidemiol，2004，25:468-471.

[3]Suzanne M Paule，Anna C Pasquariello，Richard B Thomson，et al.Real-time PCR can rapidly detect methicillinsusceptibleand methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from positive blood culture bottles[J］.Microbiology and Infectious Disease，2005，124:404-407

[4]Unal S，R Masterton，H Goossens.Bacteraemia in Europeantimicrobial susceptibility data from the MYSTIC surveillance programme[J］.Int J Antimicrob，2004，23(2):155-163.

[5]Ingeborg Hein，Angelika Lehner，Petra Rieck，et al.Comparison of different approaches to quantify Staphylococcus aureus cells by real-time quantitative PCR and application of this technique for examination of cheese[J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(7):3122-3126.

[6]Dinges M，Orwin PM，Patrick M.Schlievert exotoxins of Staphyococcus aureus[J］.Clin Microbiol Rev，2000，13(1):16-34

[7]M Klotz，S Opper，K Heeg，et al.Detection of Staphylococcus aureus enterotoxins A to D by real-time fluorescence PCR assay[J］.Journal of Clinical Microbiology，2003，41(10):4683-4687.

[8]A Ramesh，B P Padmapriya，A Chandrashekar.Applica-tion of a convenient DNA extraction method and multiplex PCR for the direct detection of Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica in milk samples[J］.Molecular and Cellular Probes，2002，16(8):307-314.

[9]Vincenzina Fusco，Grazia Marina Quero，Maria Morea.Rapid and reliable identification of Staphylococcus aureus harbouring the enterotoxin gene cluster(egc)and quantitative detection in raw milk by real time PCR[J］.International Journal of Food Microbiology，2011，144(3):528-537.

[10]Keer J T，L Birch.Molecular methods for the assessment of bacterial viability[J］.Journal of Microbiological Methods，2003，53(2):175-183.

[11]Corbette Roberts，Kelsi L Anderson，Paul M Dunman，et al.Characterizing the effect of the Staphylococcus aureus virulence factor regulator，SarA，on log-phase mRNA half-lives[J］.Journal of Bacteriology，2006，188(7):2593-2603.

[12]Takayama K，S A Kjelleberg.The role of RNA stability during bacterial stress responses and starvation[J］.Environ Microbiol，2000，2(4):355-365.

[13]Hegde SS，Shrader TE.FemABX family members are novel nonribosomal peptidyltransferases and important pathogen-specific drug targets[J］.The Journal of Biological Chemistry，2001，276(10):6998-7003.

[14]Judith Hübscher1，Andrea Jansen，Brigitte Berger-Bchi，et al.Living with an imperfect cell wall:compensation of femAB inactivation in Staphylococcus aureus[J］.BMC Genomics，2007，8(1):307.

[15]Thomas L C，Gidding H F，Ginn A N，et al.Development of a real-time Staphylococcus aureus and MRSA(SAM-)PCR for routine blood culture[J］.Journal of Microbiological Methods，2007，68(2):296-302.

[16]Jovanka M Voyich，Michael Otto，Barun Mathema.Is panton-valentine leukocidin the major virulence determinant in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease?[J］.The Journal of Infectious Diseases，2006，194(12):1761-1770.

[17]Regina Adriana de Oliveira Calsolari，Valéria Cataneli Pereir，Joo Pessoa Araújo Júnio.Determination of toxigenic capacity by reverse transcription polymerase chain reaction in coagulase-negative staphylococci and Staphylococcus aureus isolated from newborns in Brazil[J］.Microbiology and Immunology，2011，55(6):394-407.

[18]Kelsi L Anderson，Corbette Roberts，Paul M Dunman，et al.Characterization of the Staphylococcus aureus heat shock，cold shock，stringent，and SOS responses and their effects on log-phase mRNA turnover[J］.Journal of Bacteriology，2006，188(9):6739-6756.

[19]Narjol Gonzalez-Escalona，Thomas S Hammack，Mindi Russell，et al.Detection of Live salmonella sp.Cells in produce by a TaqMan-Based quantitative reverse transcriptase real-time PCR Targeting invA mRNA[J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(11):3714-3720.

[20]Caifu Chen，Dana A Ridzon，Adam J Broomer，et al.Real-time quantification of microRNAs by stem–loop RT– PCR[J］.Nucleic Acids Research，2005，33(20):e179.

[21]Vincenzina Fusco，Grazia Marina Quero，Maria Morea.Rapid and reliable identification of Staphylococcus aureus harbouring the enterotoxin gene cluster(egc)and quantitative detection in raw milk by real time PCR[J］.International Journal of Food Microbiology，2011，144(3):528-537.

[22]Matsuda K，Tsuji H，Asahara T，et al.Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR [J］.Appl Environ Microbiol，2007，73(1):37-39.

[23]Tania Nolan1，Rebecca E Hands2＆Stephen A Bustin2.Quantification of mRNA using real-time RT-PCR [J］.Nature Protocols，2006，1(3):1559-1582.

ABSTRACTThis research focuses on establishment of a way that distinguish dead Staphylococcus aureus from the viable to avoid false-positive results caused by the ordinary DNA-based polymerase chain reaction in food detection.Primer and probe are designed by ourselves.One-step reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)is applied to detect mRNA of Staphylococcus aureus femA.Results show that only living Staphylococcus aureus are positive and deaths are negative.In pure culture，the coefficient of variation is 0.15 by repeat detection，and the analytical sensitivity and detection limit of the assay are 9×102CFU/mL and 1/3 CFU/3mL respectively.Experiments have shown that the one-step reverse transcription-polymerase chain reaction assay established in this study is not only a rapid，sensitive and specific method but also can effectively distinguish the dead from the viable Staphylococcus aureus.

Key wordsStaphylococcus aureus，RT-PCR，dead and live bacteria，Ordinary PCR

Detection of Live Staphylococcus aureus Using Real-time Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction

Zhang Chong1，2，Liu Xiang1，Chen Ji-luan2
1(National Quality Supervision and Inspection Center of processed foods(Tianjin)，Tianjin 300384，China)
2(College of Food Science and Engineering in Shihezi University，Shihezi 832000，China)

碩士研究生(劉祥為通訊作者，E-mail:wenyang76@163.com)。

*國家質(zhì)檢總局科技項目(2010QK307)，天津市質(zhì)監(jiān)局科技項目(10-11)

2011-12-06，改回日期:2012-02-14