徐寅，黃玉軍，顧瑞霞，陳霞，郭飛翔，陸春良，魯茂林

1(江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室;揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州，225127)

2(揚州大學(xué)測試中心，江蘇揚州，225009)

乳酸菌對發(fā)酵豆乳風(fēng)味成分的影響*

徐寅1，黃玉軍1，顧瑞霞1，陳霞1，郭飛翔1，陸春良2，魯茂林1

1(江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室;揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州，225127)

2(揚州大學(xué)測試中心，江蘇揚州，225009)

以實驗室保藏的發(fā)酵豆乳感官特性具有差異的5株嗜熱鏈球菌為對象，研究了乳酸菌α-乙酰乳酸脫羧酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶酶活和乳酸脫氫酶等關(guān)鍵酶的酶活性、發(fā)酵豆乳特性和揮發(fā)性風(fēng)味成分間的相互關(guān)系。結(jié)果表明，發(fā)酵豆乳感官評價與乳酸菌的α-乙酰乳酸脫羧酶和α-半乳糖苷酶呈現(xiàn)顯著負相關(guān)和正相關(guān)，與風(fēng)味成分2，3-丁二酮、2-庚酮和2-壬酮呈顯著正相關(guān)，與正己醇、2，4-癸二烯醛和2-戊基呋喃呈顯著負相關(guān);發(fā)酵豆乳酸度值與乳酸菌的β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶均呈顯著正相關(guān)。

發(fā)酵豆乳，乳酸菌，風(fēng)味

發(fā)酵豆乳是以大豆為主要原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵加工而成，它既保留了豆乳原有的營養(yǎng)價值，又由于乳酸菌的發(fā)酵賦予了發(fā)酵豆乳復(fù)雜的風(fēng)味成分，同時能將大豆中的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪等加以分解，提高其消化吸收性能，并能代謝產(chǎn)生許多功能性成分。

發(fā)酵豆乳的風(fēng)味是反應(yīng)其質(zhì)量的重要部分，同發(fā)酵豆乳的質(zhì)地特性及產(chǎn)品安全性一樣是消費者接受該產(chǎn)品時考慮的關(guān)鍵因素[1］。發(fā)酵豆乳的風(fēng)味形成源于大豆原料及發(fā)酵過程[2］。目前，國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵豆乳風(fēng)味的研究主要集中在發(fā)酵條件、發(fā)酵菌種[3］、產(chǎn)品風(fēng)味質(zhì)量的感官評定[4］、豆乳發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)的比較[5］、添加牛乳[6］等物質(zhì)對風(fēng)味物質(zhì)的影響等。本文對實驗室保藏的5株嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆乳的揮發(fā)性風(fēng)味成分進行檢測分析，并結(jié)合感官評價和酶學(xué)特性，探討影響發(fā)酵豆乳風(fēng)味的因素，建立發(fā)酵豆乳風(fēng)味定向調(diào)控技術(shù)，為開發(fā)符合消費需求的發(fā)酵豆乳制品打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆:產(chǎn)地東北，市售;全脂乳粉:新西蘭威士蘭乳業(yè)公司;5株嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophi-lus)，菌株編號分別為 grx90、AM1、XN53、ST 和971-8，由揚州大學(xué)乳品生物技術(shù)與安全控制江蘇省重點實驗室保藏;鄰硝基苯β-D-半乳糖苷(oNPG)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)、對硝基苯 α-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)、溶菌酶等購自上海生工生物有限公司;其他所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FDM-Z100型自分離大豆磨漿機，江蘇鎮(zhèn)江大港晶久機械廠;FE20 pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司;SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;臺式冷凍離心機，美國Thermo公司;721可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司;SPX-250B型生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠;SPME手動進樣器、75μm CAR/PDMS萃取纖維頭，美國Supelco公司;Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵劑菌種的制備

將凍干的5株S.thermophilus(菌株編號分別為grx90、AM1、XN53、ST、971-8)分別于滅菌脫脂乳中，42℃培養(yǎng)活化3代備用。

1.3.2 發(fā)酵豆乳制備

精選大豆→浸泡(0.25%NaHCO3溶液浸泡14 h)→清洗、熱燙→磨漿(85℃熱水1∶8質(zhì)量比磨漿)→過濾→豆乳和牛乳按7∶3(v/v)混合→加入蔗糖(6%)→ 均質(zhì)(20 MPa)→熱處理(90～95℃/15 min)→冷卻(42℃)→接種不同乳酸菌發(fā)酵劑(3%接種量)→發(fā)酵(42℃)→冷藏(4℃)。

1.3.3 乳酸菌酶活性測定

將凍干的5株S.thermophilus分別接種于pH 6.4的改良MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，42℃活化3代，收集對數(shù)生長期后期的菌體用于α-乙酰乳酸脫羧酶(α-ALDC)、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶酶活、乳酸脫氫酶(LDH)活性測定[7-9］。

1.3.4 發(fā)酵豆乳發(fā)酵特性分析

pH值采用精密pH計測定;酸度采用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定;活菌數(shù)采用平板菌落計數(shù)法測定。

1.3.5 發(fā)酵豆乳風(fēng)味成分檢測分析

[12-13］，并略作修改。吸取10 mL樣品放入15 mL頂空瓶中，在45℃水浴中平衡20 min，將已老化好的萃取頭插入樣品瓶中，45℃條件下萃取40 min，然后進行GC-MS分析。

GC條件:色譜柱柱型:DB-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm);進樣口溫度 250℃，解吸1min;采用程序升溫方式:起始溫度35℃，保留3 min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至230℃，保持10 min;載氣(He)流速0.80 mL/min;不分流進樣。MS條件:電離方式EI，70 eV，離子源溫度為200℃，發(fā)射電流200μA，檢測電壓350 kV，質(zhì)量掃描范圍35～400 amu。

定性定量方法:通過對各組分計算機檢索，并與NIST質(zhì)譜庫提供的標準質(zhì)譜圖對照，報道匹配度最大的結(jié)果，通過峰面積歸一化法得到每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量(揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積/總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰面積，%)，測試樣品重復(fù)試驗1次，取平均值作為各風(fēng)味物質(zhì)相對含量。

1.3.6 發(fā)酵豆乳感官評價

選10名經(jīng)培訓(xùn)合格的食品專業(yè)人員作為品評員，參考文獻[3］，評定方法如下:采用嗅聞與品嘗結(jié)合對不同乳酸菌發(fā)酵豆乳打分。評分標準:1)0～3分:無明顯發(fā)酵香氣，滋味難以接受;2)3～5分:有輕微發(fā)酵香氣，滋味不柔和;3)5～8分:有正常發(fā)酵香氣，滋味較柔和;4)8～10分:有濃郁發(fā)酵香氣，滋味柔和。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用spss17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，除風(fēng)味成分測定外，每組試驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。顯著性分析采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同乳酸菌酶活性測定結(jié)果

5株 S.thermophilus(菌株編號分別為 grx90、AM1、XN53、ST、971-8)在 MRS 培養(yǎng)基中酶活性測定結(jié)果如表1所示。

表1 乳酸菌酶活性測定結(jié)果1)

從酶活性測定結(jié)果可以看出，不同乳酸菌的酶活性存在差異，菌株grx90的α-乙酰乳酸脫羧酶活力顯著低于其他菌株(P＜0.05);菌株971-8的α-半乳糖苷酶活力顯著低于其他菌株(P＜0.01)，僅為0.545 U/mL，而菌株grx90的α-半乳糖苷酶活力顯著高于其他菌株(P＜0.05);各菌株β-半乳糖苷酶活力均較低，其中菌株ST的β-半乳糖苷酶活力顯著低于其他菌株(P＜0.01);各菌株的乳酸脫氫酶活力存在差異，在0.176～0.654 U/mL，其中菌株971-8的乳酸脫氫酶活力最大。

2.2 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳特性比較

用5株S.thermophilus菌株分別制備發(fā)酵豆乳，發(fā)酵特性以及感官評價測定結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯煌樗峋l(fā)酵豆乳發(fā)酵結(jié)束時滴定酸度在45～56°T，pH 值在 4.52～4.62，乳酸菌活菌數(shù)在(1.02×108)～(2.45×108)CFU/mL，不同樣品滴定酸度和活菌數(shù)均有顯著差異(P＜0.05)，而pH值差異不顯著(P＞0.05)。從感官評價發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌發(fā)酵豆乳呈味特征有較大差異，菌株grx90和AM1發(fā)酵豆乳感官評分較高，呈現(xiàn)濃郁并較為協(xié)調(diào)的發(fā)酵香氣，而菌株ST和971-8發(fā)酵豆乳發(fā)酵香氣較弱，并伴有令人不愉快的尖酸氣息。

表2 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳特性分析1)

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

對5株S.thermophilus發(fā)酵豆乳樣品經(jīng)4℃貯藏24 h后，以未發(fā)酵的豆乳為對照，采用HS-SPME-GCMS進行揮發(fā)性風(fēng)味成分測定，結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵豆乳揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

續(xù)表3

未發(fā)酵豆乳共檢測出35種主要揮發(fā)性風(fēng)味成分，由醛、醇、酮、酸和呋喃構(gòu)成，其中醛類占整個揮發(fā)性風(fēng)味成分的比例最大，達到49.01%;其次是醇類24.01%;呋喃類13.02%;酮類10.84%。豆乳經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后，共檢測出42種風(fēng)味成分，豆乳發(fā)酵前后在風(fēng)味構(gòu)成成分、數(shù)量和相互比例上差異較大，酮、酸、醇類化合物種類及含量明顯增加，醛類化合物則明顯減少，呋喃類物質(zhì)變化不大。不同乳酸菌發(fā)酵豆乳風(fēng)味成分在總體組成上差別不大，含35種共有風(fēng)味成分，但不同風(fēng)味成分的含量存在差異。發(fā)酵豆乳中醇類所占比例最大，占發(fā)酵豆乳總揮發(fā)性風(fēng)味成分的54.25%～57.15%;其次是酮類(17.38%～21.81%);呋喃類(11.68%～12.67%);酸類(6.26%～7.26%);醛類(4.56%～5.81%)。

3 分析與結(jié)論

3.1 乳酸菌酶活性與發(fā)酵豆乳特性相關(guān)性分析

對5株S.thermophilus的4個酶活性與發(fā)酵豆乳發(fā)酵特性及感官評價進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆乳感官評價與乳酸菌的α-乙酰乳酸脫羧酶和α-半乳糖苷酶分別呈現(xiàn)顯著負相關(guān)和正相關(guān);發(fā)酵豆乳酸度值與乳酸菌的β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶均呈顯著正相關(guān)，而發(fā)酵豆乳感官評價與酸度值間并未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性(結(jié)果如圖1所示)。

圖1 乳酸菌酶活性、發(fā)酵豆乳酸度和感官評價相關(guān)性分析

3.2 發(fā)酵豆乳感官評價與揮發(fā)性風(fēng)味成分相關(guān)性分析

不同的揮發(fā)性成分具有不同的呈味特征，對發(fā)酵豆乳風(fēng)味起不同程度的貢獻作用，根據(jù)呈味特性、相對含量、閾值，結(jié)合參考文獻[12］，選取風(fēng)味成分正己醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇、2，3-丁二酮、2，3-戊二酮、2-庚酮、2-壬酮、3-羥基-2-丁酮、己酸、辛酸、2-庚烯醛、2，4-癸二烯醛和2-戊基呋喃為研究對象，與發(fā)酵豆乳的感官評價做相關(guān)性分析，如表4所示。

表4 發(fā)酵豆乳感官評價和揮發(fā)性風(fēng)味成分相關(guān)性分析

通過分析不同S.thermophilus菌株發(fā)酵豆乳的感官評價與揮發(fā)性風(fēng)味成分相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆乳感官評價與多數(shù)酮類物質(zhì)呈正相關(guān)，其中與2，3-丁二酮、2-庚酮和2-壬酮呈顯著正相關(guān)，2，3-丁二酮的含量與α-乙酰乳酸脫羧酶活力呈顯著負相關(guān)，可見在乳酸菌代謝豆乳中檸檬酸產(chǎn)生2，3-丁二酮的過程中，α-乙酰乳酸脫羧酶起到了關(guān)鍵作用。發(fā)酵豆乳與醇、醛和呋喃類的各主要成分均呈不同程度的負相關(guān)，其中與正己醇、2，4-癸二烯醛和2-戊基呋喃呈顯著負相關(guān)，而與己酸、辛酸的相關(guān)性均不顯著。

發(fā)酵豆乳的風(fēng)味不是由單一風(fēng)味成分所決定的，而是由醇、酮、酸、醛、呋喃等多類化合物共同作用構(gòu)成。乳酸菌對發(fā)酵豆乳風(fēng)味具有重要影響，通過研究發(fā)現(xiàn)，S.thermophilus grx90具有較弱的α-乙酰乳酸脫羧酶活力，產(chǎn)生了良好的發(fā)酵風(fēng)味，從而獲得較好的感官評價，是豆乳發(fā)酵的優(yōu)選菌種。因此，在發(fā)酵豆乳微生物篩選過程中以酶學(xué)特性為指標定向篩選乳酸菌不失為一種研究方法。

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ABSTRACTInfluence of Lactic Acid Bacteria on the Flavor of Fermented Soymilk Five Streptococcus thermophilus stored in laboratory with different sensory characteristics of fermented soymilk were studied.The activities of enzymes from lactic acid bacteria such as α-acetolactate decarboxylase(α-ALDC)，α-galactosidase，β-galactosidase ，and lactate dehydrogenase(LDH)，and the characteristics and flavor compounds of fermented soymilk were measured.Their correlation was also discussed.The results showed that the sensory evaluation of fermented soymilk was significant negatively and positively correlated with α-ALDC and α-galactosidase respectively，and was significant positively correlated with flavor compounds of 2，3-butanedione，2-heptanone and 2-nonylketone，was significant negatively correlated with hexanol，2，4-decadienal and 2-pentylfuran.Simultaneously，the acidity of fermented soymilk was significant positively correlated with β-galactosidase and LDH.

Key wordsfermented soymilk，lactic acid bacteria，flavor

Influence of Lactic Acid Bacteria on the Flavor of Fermented Soymilk

Xu Yin1，Huang Yu-jun1，Gu Rui-xia1，Chen Xia1，Guo Fei-xiang1，Lu Chun-liang2，Lu Mao-lin1
1(Jiangsu Province Key Lab of Dairy Biotechnology and Safety Control College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，China)
2(Test Center of Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)

碩士研究生(顧瑞霞教授為通訊作者)。

*江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目;國家863計劃項目(2007AA10Z357);江蘇省科技支撐項目(BE2011383);教育部博士點基金(20093250110005);2010年度“江蘇省研究生教育創(chuàng)新工程”項目

2012-02-06，改回日期:2012-02-27