郝曉然，牟聰華，喬旭光

(山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

大蒜綠變過程中幾種關鍵物質的變化規(guī)律*

郝曉然，牟聰華，喬旭光

(山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

研究測定了4℃貯藏條件下大蒜綠變強度、三羧酸循環(huán)中間物有機酸和δ-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid，ALA)含量的變化。結果表明:隨著貯藏時間的延長，大蒜綠變強度增大，檸檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸含量和ALA含量均明顯增加。經(jīng)鈣離子調(diào)控三羧酸循環(huán)后，大蒜的綠變強度、檸檬酸和α-酮戊二酸含量逐漸升高，延胡索酸含量逐漸降低;經(jīng)丙二酸調(diào)控三羧酸循環(huán)后，大蒜綠變強度先升高后降低，延胡索酸含量顯著降低，表明三羧酸循環(huán)可以影響大蒜綠色素的形成。

大蒜綠變，檸檬酸，α-酮戊二酸，延胡索酸，δ-氨基酮戊酸

大蒜(Allium Sativum L.)鱗莖具有極高的營養(yǎng)價值，含有蛋白質、糖類、脂肪、維生素和鈣、磷、鐵、硒、鍺等礦物元素。另外，大蒜及其制品還有很高的藥用價值，有殺菌、防止動脈粥樣硬化和血小板凝集、防止血栓的形成、抗糖尿病、提高機體的免疫能力等多方面的作用[1］。但是大蒜在加工過程中，特別是解除休眠以后，容易發(fā)生綠變現(xiàn)象，嚴重影響大蒜制品的外觀質量和品質[2］，成為妨礙大蒜深加工，造成大蒜生產(chǎn)加工企業(yè)嚴重經(jīng)濟損失的主要問題。

目前已有研究人員通過 Paar-Knnor反應[3，4］，用6種包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等側鏈較小的疏水氨基酸與2，5-二甲氧基四氫呋喃體外合成吡咯基氨基酸，通過加入外源吡咯基纈氨酸可使大蒜變綠，證明了它可能就是大蒜綠色素的前體物質[5］。Shinsuke Imai等體外模擬色素形成時發(fā)現(xiàn)，丙烯基硫代亞磺酸酯與丙氨酸或纈氨酸反應生成N-(3，4-二甲基)吡咯基氨基酸類化合物，此物質再與烯丙基硫代亞磺酸酯生成紫紅色素[6］。陳聰采用固相萃取法，吸附樹脂法和凝膠層析法對大蒜綠色素進行了分離純化，通過核磁共振對綠色素結構進行了鑒定。研究得出綠色素的分子量為527，初步判斷其結構含有吡咯環(huán)[7］。Wang D等用丙酮酸分別與P-甘氨酸、P-纈氨酸和P-異亮氨酸反應制得三種黃色素，鑒定結構發(fā)現(xiàn)均含有吡咯環(huán)[8］;Hu D等制備的 P-天冬氨酸和 P-谷氨酸可以使新蒜發(fā)生綠變[9］。這些結果都直接證明了吡咯基化合物是大蒜綠色素的前體物質。

已有的研究表明大蒜綠色素不是葉綠素[19］，其紫外可見吸收峰在 440nm 和 590nm[20，21］，與葉綠素的吸收峰不同，但其生物合成途徑可能與葉綠素的合成途徑有相似之處。因此，本試驗以低溫強制解除休眠的大蒜為原料，測定大蒜綠變前后TCA中間物檸檬酸、α-酮戊二酸和延胡索酸含量的變化，分別采用鈣離子和關鍵步驟酶琥珀酸脫氫酶的底物類似物丙二酸，控制循環(huán)的速度，促進琥珀酰CoA向吡咯基化合物的轉化，揭示TCA與大蒜綠變的關系，以期從本質上闡明大蒜綠色素的生物合成途徑，提出切實可行的生產(chǎn)上控制綠變發(fā)生的措施。

1 材料與方法

1.1 材料

貯藏在4℃中無病蟲害、無機械損傷的邳州大蒜。

1.2 主要儀器

Unic UV-2000紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;TGL-18C高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大蒜綠變強度的測定

取大蒜鱗莖20.00 g除芽后搗碎，加入2%檸檬酸，攪拌均勻后于80℃水浴加熱30 min，室溫冷卻后用95%乙醇定容至50 mL，4℃浸提24h，過濾后取上清液測定440 nm、590 nm處的吸光值。

定義:綠變強度=A590(440)×10。

1.3.2 TCA中間物有機酸對大蒜綠變的影響

1.3.2.1 有機酸含量測定方法

參考沈宏等[22］的方法。有機酸提取:取大蒜鱗莖1.00 g，除芽后加入2 mL去離子水研磨成漿，再加入3 mL去離子水將其洗入離心管中，9000 r/min離心30 min，取上清液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過濾，用于測定TCA中有機酸。

參考崔玉林[23］，李紅衛(wèi)等[24］的方法。測定條件:紫外檢測器，Alltiman C18Column(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流速:0.4 mL/min，進樣體積:20 μL，檢測波長:214 nm，柱溫:30℃，流動相:含5%甲醇的0.01 moL/L H3PO4-KH2PO4緩沖液(pH 2.35)。

1.3.2.2 鈣離子處理大蒜的方法

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0軟件完成統(tǒng)計學分析,各組間計量資料比較采用成組t檢驗,各組采用均數(shù)±標準差(±s)表示,計數(shù)資料采用卡方檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

挑選大小一致的大蒜，去皮剝瓣，切片除芽，取適量蒜片放到不同濃度的CaCl2溶液中浸泡15 min，室溫(25℃)下瀝干，在去離子水中浸泡的蒜片設為對照組，測定經(jīng)不同濃度CaCl2溶液處理后大蒜的綠變強度和TCA中間物有機酸含量變化[25］。

1.3.2.3 丙二酸處理大蒜的方法

挑選大小一致的大蒜，去皮剝瓣，切片除芽，按大蒜質量添加不同濃度丙二酸破碎，以不加丙二酸的大蒜設為對照組，測定經(jīng)不同濃度丙二酸處理后大蒜的綠變強度和延胡索酸含量變化。

1.3.3 ALA含量的測定

參考王凌健[26］，郭進魁等[27］的方法。取大蒜鱗莖1.50 g，除芽后加入8 mL 4%的三氯乙酸溶液中研磨，離心后取上清液與乙酸鈉緩沖液和乙酰丙酮混合，沸水浴中加熱10 min，后冷卻至室溫，然后取樣品液按照體積比1∶1的比例加入Ehrlich’s試劑，顯色后于553 nm處測定吸光值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)用SAS9.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏時間大蒜綠變強度

由圖1可知，在4℃貯藏條件下，隨著貯藏時間的延長，大蒜綠變強度逐漸增大。低溫貯藏8 d以后，大蒜綠變強度急劇增大。低溫貯藏有助于解除大蒜休眠，促進代謝水平提高，但由于合成葉綠素的途徑在低溫下受阻，導致大蒜綠色素合成物質的產(chǎn)生和積累，綠變現(xiàn)象加重。

圖1 不同貯藏時間大蒜綠變強度變化

2.2 TCA中間物有機酸對大蒜綠變的影響

2.2.1 不同貯藏時間大蒜中TCA中間物有機酸含量的變化

圖2表明，隨著貯藏時間的延長，大蒜中檸檬酸、α-酮戊二酸和延胡索酸含量逐漸升高，與大蒜綠變強度變化趨勢一致。

圖2 不同貯藏時間大蒜中檸檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸含量變化

分別對不同貯藏時間大蒜綠變強度與檸檬酸、α-酮戊二酸和延胡索酸含量進行相關分析，如表1所示，大蒜綠變強度與檸檬酸、α-酮戊二酸和延胡索酸含量變化具有極顯著相關性，進一步表明了大蒜解除休眠后，TCA增強，與大蒜綠色素生物合成有關的各種生理活動變得活躍，但由于低溫條件下阻斷了葉綠素的合成，造成吡咯基化合物累積，進而為大蒜綠色素的合成提供了物質條件。研究推測TCA對大蒜綠變的影響是經(jīng)循環(huán)中間物α-酮戊二酸、琥珀酰CoA進入吡咯化合物合成途徑，該吡咯化合物為大蒜綠色素的合成提供前體物質，進而證明TCA與大蒜綠變有關。

表1 有機酸和大蒜綠變強度(440 nm)相關性

表2 有機酸和大蒜綠變強度(590 nm)相關性

2.2.2 Ca2+調(diào)控TCA對大蒜綠變的影響

Ca2+對TCA中的丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶都有激活作用[28］。由圖3、圖4可看出，隨著Ca2+濃度的增加，大蒜的綠變強度不斷增大，檸檬酸和α-酮戊二酸含量增加顯著，延胡索酸含量逐漸降低。

圖3 不同濃度Ca2+處理大蒜后綠變強度變化

圖4 不同濃度Ca2+處理大蒜后檸檬酸、α-酮戊二酸和延胡索酸含量變化

延胡索酸含量減少，可能是由于α-酮戊二酸經(jīng)氧化脫羧生成琥珀酰CoA，之后轉化形成吡咯基化合物，導致琥珀酰CoA向延胡索酸的轉化量減少。這與4℃貯藏不同時間后大蒜TCA中間物有機酸含量變化的研究結果一致。

2.2.3 丙二酸調(diào)控TCA對大蒜綠變的影響

TCA中的琥珀酸脫氫酶可以催化琥珀酸向延胡索酸轉化，丙二酸的分子結構與琥珀酸類似，所以可與琥珀酸競爭性地與酶的活性中心結合，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑[18］。丙二酸與琥珀酸脫氫酶的親和力遠大于琥珀酸本身對它的親和力，因此抑制作用很強，對其有很強的抑制作用。

由圖5、圖6可以看出，隨著丙二酸濃度的增加，大蒜綠變強度先升高后降低，但均高于對照組。延胡索酸的含量逐漸降低，是由于丙二酸作用于琥珀酸脫氫酶，使其活性降低，導致琥珀酸積累，從而降低了琥珀酰CoA向琥珀酸的轉化速率，利于琥珀酰CoA生成吡咯基化合物，所以大蒜綠變強度增大，延胡索酸生成量減小。丙二酸可以抑制細胞呼吸[18］，當其濃度高于0.4%時，其抑制程度過大，阻斷了TCA，導致琥珀酰CoA向吡咯基化合物轉化反應受阻，大蒜綠變強度開始降低。

圖5 不同濃度丙二酸處理大蒜后綠變強度變化

圖6 不同濃度丙二酸處理大蒜后延胡索酸含量變化

3 ALA與大蒜綠變的關系

崔海瑞等[16］研究表明低溫條件下水稻ALA積累量明顯高于高溫條件下。由圖7可以看到隨著貯藏時間延長ALA含量不斷增加。對不同貯藏時間大蒜綠變強度與ALA含量進行相關分析，結果表明，在440 nm和590 nm測定條件下，大蒜綠變強度與ALA含量之間的相關系數(shù)分別是 r=0.9795＊＊和r=0.9978＊＊，呈現(xiàn)極顯著相關性，表明ALA是大蒜綠色素生物合成的關鍵物質。

圖7 不同貯藏時間大蒜ALA含量的變化

，4 結論

4℃貯藏條件下，隨著貯藏時間的延長，TCA中間物檸檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸的含量不斷增加，與綠變強度變化相關性極顯著;ALA含量不斷升高，且與綠變強度相關性極顯著。表明TCA可促進大蒜綠色素前體吡咯基化合物的生成，與大蒜綠變密切相關。

Ca2+調(diào)控 TCA后，隨著 Ca2+濃度的增加，TCA中間物檸檬酸、α-酮戊二酸的含量明顯增高，延胡索酸含量顯著降低，綠變強度增大;丙二酸調(diào)控TCA后，隨著丙二酸濃度的增加，大蒜綠變強度先升高后降低，延胡索酸含量顯著降低。進一步表明TCA影響與大蒜綠色素生物合成有關的生理活動。推測TCA對大蒜綠變的影響是經(jīng)循環(huán)中間物α-酮戊二酸、琥珀酰CoA進入吡咯化合物合成途徑，該吡咯化合物為大蒜綠色素的合成提供前體物質。

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ABSTRACTIn order to determine the biosynthesis of garlic greening，the contents of citric acid，α-ketoglutarate，fumarate and δ-ALA were investigated.The results showed that with the storage time prolonged，the contents of citric acid，α-ketoglutarate，fumarate and ALA increased significantly，the strength of garlic greening was with the same trend.Treatment with Ca2+could increase the content of citric acid，α-ketoglutarate and the strength of garlic greening，but decrease the content of fumarate significantly.Malonic acid can reduce the content of fumarate significantly，the garlic greening rate increased first and then decreased slightly.It showed that tricarboxylic acid cycle and biosynthesis of garlic green pigment was correlated.

Key wordsgarlic greening，citric acid，α-ketoglutarate，fumarate，δ-aminolevulinic acid

Effects of Several Key Substances on Garlic Greening

Hao Xiao-ran，Mou Cong-hua，Qiao Xu-guang
(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China)

碩士研究生(喬旭光教授為通訊作者，Email:xgqiao@sdau.edu.cn)

*國家自然科學基金(30972040)和高等學校博士學科點專項科研基金(20093702110002)資助

2012-02-14，改回日期:2012-04-18