雷麗華，鄭仁朝，柳志強(qiáng)，黎小軍，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)

雷麗華，鄭仁朝，柳志強(qiáng)，黎小軍，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

Thermomyces lanuginosus脂肪酶(簡(jiǎn)稱TLL)是具有重要商業(yè)應(yīng)用價(jià)值的脂肪酶之一。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，從Thermomyces lanuginosus ZJB09222基因組中克隆得到885 bp脂肪酶基因cDNA序列，其結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白包含292個(gè)氨基酸。將脂肪酶基因cDNA序列開放閱讀框克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建了基因工程菌E.coli BL21/pET28b-TLL。誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE電泳顯示該脂肪酶分子量約為32 ku。篩選獲得廉價(jià)重組菌培養(yǎng)基，表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)OD600約為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，在28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h，酶活達(dá)到41 U/mL。

脂肪酶，Thermomyces lanuginosus，克隆，大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)

脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3)是一類能夠催化長(zhǎng)鏈甘油三酯水解生成甘油二酯和羧酸及其逆反應(yīng)的絲氨酸水解酶[1］。同時(shí)，它們也能夠在有機(jī)溶劑中高效催化各種非天然底物的酯化、轉(zhuǎn)酯、氨解等反應(yīng)。因此，脂肪酶在食品、洗滌、紡織、飼料、能源等加工業(yè)中應(yīng)用廣泛[2］，是最重要的工業(yè)酶制劑之一。隨著生物催化技術(shù)在支撐工業(yè)可持續(xù)發(fā)展中重要性的不斷顯現(xiàn)，脂肪酶作為高效、高立體選擇性生物催化劑的功能日益受到重視，其中熱穩(wěn)定、高活力的脂肪酶具有無(wú)可比擬的開發(fā)和應(yīng)用前景。

疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一種分布廣泛，生長(zhǎng)上限溫度較高的真菌，能夠產(chǎn)生系列具有重要工業(yè)價(jià)值的熱穩(wěn)定纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶等[3］。T.lanuginosus脂肪酶(TLL)屬于堿性脂肪酶，最適反應(yīng)pH 8.0，在pH值4.0～11.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度60℃，在65℃下仍能保持較高活性[4］，用于食品加工、油脂化學(xué)品工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌和生物表面活性劑合成等行業(yè)[5］。在有機(jī)合成領(lǐng)域，該脂肪酶用于糖衍生物的區(qū)域選擇性水解、外消旋體拆分[6］和前手性酯的不對(duì)稱水解等[7-8］。與其他嗜熱真菌脂肪酶相比，TLL 活性最高[9］。

由于嗜熱真菌的特殊屬性，野生菌發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)TLL存在較多困難。采用分子生物學(xué)手段，構(gòu)建適于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的工程菌就成為必然要求。1998年，Boel最先克隆了T.lanuginosus脂肪酶的mRNA序列(AF054513);1998年，申請(qǐng)美國(guó)專利“Humicola lanuginose lipase produced in Aspergillus”，用異源絲狀真菌表達(dá)生產(chǎn)脂肪酶。Novozymes在2002年成功將T.lanuginosus脂肪酶與Fusarium oxysporum脂肪酶融合在一起構(gòu)成“hybrid”脂肪酶，并在Aspergillus oryzae中表達(dá)成功。該重組脂肪酶已經(jīng)成為洗滌劑用酶的主力。2004年 Prathumpai等人用黑曲霉表達(dá)TLL[10］。他們利用米曲霉淀粉酶啟動(dòng)子和黑曲霉葡萄糖苷酶終止子，將疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因(AF054513)在黑曲霉中表達(dá)。但SDS-PAGE分析顯示，絕大部分脂肪酶結(jié)合在細(xì)胞壁上，未能分泌。國(guó)內(nèi)鄭艷等根據(jù)已報(bào)道TLL序列(AF054513)設(shè)計(jì)特異引物，在畢赤酵母中成功表達(dá)[11］。

與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)，成本低等特點(diǎn)，是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早和目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。本研究擬從實(shí)驗(yàn)室保存的疏棉狀嗜熱絲孢菌中克隆出脂肪酶基因，在E.coil BL21(DE3)中表達(dá)，并優(yōu)化重組菌的表達(dá)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

Thermomyces lanuginosus ZJB09222由本實(shí)驗(yàn)室保藏;大腸桿菌JM109、BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-28b由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒 pMD18-T Vector購(gòu)自 TaKaRa公司。

1.1.2 酶與化學(xué)試劑

T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ購(gòu)自Fermentas公司，膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒、IPTG、氨芐青霉素、卡那霉素、DL2000 DNA Maker、Taq DNA 聚合酶等試劑購(gòu)自 TaKaRa公司。對(duì)硝基苯乙酸酯(pNPA)、對(duì)硝基苯丁酸酯(pNPB)、對(duì)硝基苯月桂酸酯(pNPL)和對(duì)硝基苯棕櫚酸酯(pNPP)均購(gòu)自Sigma公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列測(cè)定由上海桑尼有限公司完成。其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

T.lanuginosus ZJB09222培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

本研究所用大腸桿菌培養(yǎng)基(pH 7.0，g/L)如下:

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10;IG培養(yǎng)基:蛋白胨 20，酵母粉 12，NaCl 10，甘油 10 mL，KH2PO41.5，K2HPO42.3，MgSO4·7H2O 0.25;TB 培養(yǎng)基:蛋白胨 12，酵母粉 24，甘油6，NaCl 10，KH2PO42.4，K2HPO4·3H2O 12.5;2-YT 培養(yǎng)基:蛋白胨 16，酵母10，NaCl 5;DB培養(yǎng)基:蛋白胨 7，酵母粉 8，甘油 3，K2HPO42，MgSO42，NaCl 10;DLB 培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10;DGL培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，甘油 5;DST培養(yǎng)基:蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 10，淀粉5;DG培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，葡萄糖5;DM培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，麥芽糖5;DS培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，蔗糖5;DF培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，D-果糖 5;DL 培養(yǎng)基:蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 10，乳糖5;DMA培養(yǎng)基:蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 10，甘露醇5;DBM培養(yǎng)基:蛋白胨7，酵母粉8，甘露醇 3，K2HPO42，MgSO42，NaCl 10。

除LB、IG、TB和2-YT培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母粉購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司外，其余培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母粉均為國(guó)產(chǎn)生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 真菌總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

TRIzol法提取總RNA。采用RT-PCR的方法從T.lanuginosus ZJB09222菌中分離脂肪酶基因，使用TaKaRa公司RT-PCR試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，反應(yīng)體系及條件均參照試劑盒的使用說(shuō)明。并經(jīng)紫外檢測(cè)和0.9%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其大小及濃度。-20℃保存，待用。

1.2.2 全長(zhǎng)cDNA的克隆

以cDNA第一鏈為模板，利用PCR方法擴(kuò)增脂肪酶cDNA序列。所用引物序列為:上游引物ZS(5'-ATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3');下游引物GY(5'-CGCCGCGCACTAAAGACATGA-3')[11］。 PCR 程 序?yàn)?94℃預(yù)變性4min;94℃1min，52℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收后，與pMD18-T載體16℃連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上。挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定后，將陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。

1.2.3 TLL成熟肽基因的分離與大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建

根據(jù)已獲得的脂肪酶全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)表達(dá)引物(LEIEP1:5'-AG GCCATGGGTAGTCCTATTCGTCGAGAG-3'，LEIEP2:5'-CCC AAGCTTTTACGCCGCGCACTAAAGAC-3')，用于去除非編碼區(qū)序列和信號(hào)肽序列。為保證該脂肪酶基因定向插入載體中，在上下游引物兩端分別引入NcoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)(加下劃線部分)。PCR程序同前所述，退火溫度為55℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上。挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序證實(shí)。將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證含TLL成熟肽基因的質(zhì)粒pMD18-T/TLL用NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，回收插入片段，并與同樣雙酶切的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28b進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28b-TLL，轉(zhuǎn)化 E.coli BL21(DE3)，經(jīng) Kan抗性篩選，進(jìn)行菌落PCR鑒定，重組質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)。TLL大腸桿菌基因工程菌命名為E.coli BL21(DE3)/pET28b-TLL。

1.2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

通過(guò)測(cè)定重組脂肪酶酶活以及生物量，篩選較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，即將重組菌分別在37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接于50 mL含Kan的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，200 r/min培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h后，離心收集菌體。菌體用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)溶解并混合均勻，稀釋一定倍數(shù)后，進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物10000 r/min離心5 min，棄上清并收集菌體，再取適量無(wú)菌水重懸菌體，取20 μL菌懸液加入等體積的2×Loading buffer，混勻后煮沸10 min。離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析(80 V，120 min)，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色3 min，再用脫色液[V(甲醇)∶V(冰醋酸)∶V(蒸餾水)=1∶1∶8)］脫色。

1.2.6 脂肪酶活力測(cè)定

用無(wú)水乙醇溶解一定量pNPL，配成2.5 mmol/L底物溶液。取80 μL菌液加入840 μL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)中，30℃ 金屬浴上保溫2min，再加入80 μL底物溶液充分振蕩混勻2 min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm下的吸光值。

酶活(U)單位定義:在 pH 8.0，30℃條件下，每分鐘分解pNPL產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚(黃色)所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLL基因的克隆

TRIzol法提取總 RNA。使用Eppendorf公司的核酸蛋白測(cè)定儀估測(cè)RNA質(zhì)量，測(cè)定A260/A280比值為2.0，可見(jiàn)得到的RNA較均一。由于甲醛變性凝膠電泳繁瑣且上樣量較大，故采用普通電泳檢測(cè)，即0.9%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性(圖1 A)。通過(guò)RT-PCR得到cDNA第一條鏈(圖1 B)，用特異性引物對(duì)ZS和GY擴(kuò)增出一條約0.9 kb的目的條帶(圖2)，片段大小與已報(bào)道的來(lái)源于T.lanuginosus脂肪酶基因(EU022703.1)大小相近，測(cè)序后證實(shí)僅有2個(gè)堿基不同，即619位堿基T變?yōu)镃，636位堿基G變?yōu)锳，翻譯后的氨基酸序列也有兩氨基酸不同，即207位L變?yōu)镻，213位G變?yōu)镽。至此，已成功分離出T.lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因全長(zhǎng)cDNA序列。

2.2 重組菌的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增得到的TLL成熟肽編碼基因克隆到克隆載體pMD18-T，CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli JM109，通過(guò)菌落PCR，酶切并測(cè)序驗(yàn)證，得到重組質(zhì)粒并命名為pMD18-T/TLL。經(jīng)過(guò)酶切、連接，克隆到含強(qiáng)啟動(dòng)子的大腸桿菌表達(dá)載體 pET-28b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28b-TLL，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出分子量約32 ku的目的蛋白(圖3)，檢測(cè)具有脂肪酶活性，成功構(gòu)建TLL基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-TLL。

2.3 重組菌的表達(dá)條件優(yōu)化

圖1 T.lanuginosus RNA電泳分析(A)和RT-PCR產(chǎn)物電泳分析(B)

圖2 全長(zhǎng)cDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

圖3 誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

為了考察重組脂肪酶對(duì)脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度的選擇性，選用2.5 mmol/L對(duì)硝基苯乙酯(pNPA)、對(duì)硝基苯丁酸酯(pNPB)、對(duì)硝基苯月桂酸酯(pNPL)、對(duì)硝基苯棕櫚酸酯(pNPP)作為底物，檢測(cè)重組脂肪酶對(duì)不同底物的催化能力，結(jié)果如圖4。以pNPA、pNPB為底物時(shí)的活力僅有以pNPL為底物時(shí)的10%～40%。可見(jiàn)重組脂肪酶對(duì)較長(zhǎng)碳鏈脂肪酸酯的催化效率高，即對(duì)較長(zhǎng)碳鏈脂肪酸有較高的親和性。因此，選擇pNPL作為酶活測(cè)定底物。

圖4 重組脂肪酶對(duì)不同鏈長(zhǎng)脂肪酸酯的催化活性

2.3.1 不同培養(yǎng)基的選擇

為了提高重組脂肪酶的表達(dá)量，考察了部分已報(bào)道大腸桿菌培養(yǎng)基對(duì)酶活的影響，如圖5所示。結(jié)果表明，添加甘油能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，酶活也得到提高。其中在IG培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，酶活和干重均達(dá)到最高，其次是DB和DMA培養(yǎng)基。由于進(jìn)口蛋白胨、酵母粉價(jià)格較高，進(jìn)一步以DB、DBM、DGL和DMA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別比較0.2 mmol/L IPTG和1%乳糖的誘導(dǎo)效果，結(jié)果如圖6所示。1%乳糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量?jī)H為0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下的50%。在IPTG誘導(dǎo)下，DB培養(yǎng)基中重組脂肪酶活力最高，達(dá)26 U/mL。

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

2.3.2 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，以IPTG為誘導(dǎo)劑，考察了不同誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響(如圖7)。確定該重組菌誘導(dǎo)表達(dá)最佳條件為:OD600為0.6～0.8時(shí)，加入 IPTG至終濃度為 0.1 mmol/L，28℃誘導(dǎo)7 h，脂肪酶的酶活最高達(dá)到41 U/mL，比優(yōu)化前提高了1.6倍。

3 討論

圖6 不同誘導(dǎo)劑對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

圖7 誘導(dǎo)劑濃度(A)、誘導(dǎo)溫度(B)及誘導(dǎo)時(shí)間(C)對(duì)重組酶表達(dá)的影響

疏棉狀嗜熱絲孢菌是一種分布廣泛、最適生長(zhǎng)溫度較高的真菌，能夠產(chǎn)生具有重要工業(yè)價(jià)值的熱穩(wěn)定脂肪酶。但是野生菌生產(chǎn)脂肪酶需在高溫下培養(yǎng)(60℃)，造成實(shí)際生產(chǎn)中菌體培養(yǎng)困難、能耗高。此外，其工業(yè)化生產(chǎn)還受到如誘導(dǎo)劑高黏度油脂與產(chǎn)物分離困難等因素的限制。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)手段，將嗜熱真菌熱穩(wěn)定脂肪酶基因?qū)胫袦貑渭?xì)胞微生物中高效表達(dá)成為十分有效的途徑。

雖然黑曲霉和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)都成功實(shí)現(xiàn)了高活性TLL的表達(dá)[10-11］，但由于黑曲霉和畢赤酵母都屬于好氧微生物，發(fā)酵過(guò)程通氧量大，且黑曲霉和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本相對(duì)較高。而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)化產(chǎn)酶中具有十分顯著的優(yōu)勢(shì)。

本研究成功構(gòu)建了E.coil BL21(DE3)/pET28b-TLL基因工程菌，首次實(shí)現(xiàn)了TLL在大腸桿菌中的重組表達(dá)，確定了廉價(jià)培養(yǎng)基和較優(yōu)表達(dá)條件，當(dāng)OD600約為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，在28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h，酶活達(dá)到41 U/mL，為高效、低成本TLL的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Cousin X，Hotelier T，Giles K，et al..The alpha/beta fold family of proteins database and the cholinesterase gene server[J］.Nucleic Acids Research，1997，25:143-146.

[2]Sangeetha R，Arulpandi I，Geetha A.Bacterial lipases as potential industrial biocatalysts:An overview [J］.Research Journal of Microbiology，2011，6(1):1-24.

[3]Janda K.The lipolyticactivity of Thermomyces lanuginosus strains isolated from different natural sources[J］.International Biodeterioration ＆ Biodegradation，2005，55:149-152.

[4]Maheshwari R，Bharadwaj G，Bhat M K.Thermophilic fungi:heir physiology and enzymes[J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2000，64(3):461-488.

[5]Roberto FL.Lipase from Thermomyces lanuginosus:Uses and prospects as an industrial biocatalyst[J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2010，62(3/4):197-212.

[6]Palomo JM，Lorente GF，Guisdn JM.Modulation of immobilized lipase enantioselectivity via chemical amination[J］.Advanced Synthesis＆ Catalysis，2007，349(7):1119-1127.

[7]Cabrera ZD，Palomo JM，Gloria FL.Partial and enantioselective hydrolysis of diethyl phenylmalonate by immobilized preparations of lipase from Thermomyces lanuginosus[J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40(5):1280-1285.

[8]Cai J F，Guan Z，He Y H.The lipase catalyzed asymmetric C-C Michael addition[J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2010:1-5.

[9]Johri BN，Ahmad S.Thermophilie Moulds in Biotechnology[M］.Netherlands:Kluwer Academic publishers，1999.

[10]Prathumpai W，F(xiàn)litter SJ，McIntyre M.Lipase production by recombinant strains of Aspergillus niger expressing a lipase-encoding gene from Thermomyces lanuginosus[J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，65(6):714-719.

[11]鄭艷，周波，宋寧寧，等.疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J］.菌物學(xué)報(bào)，2009，28(2):268-274.

ABSTRACTThermomyces lanuginosus lipase is one of the most important industrial enzymes.Based on published DNA sequence，the full length cDNA of the lipase was cloned using RT-PCR method.It revealed that the cDNA of the T.lanuginosus lipase gene encoded a protein lipase of 292 amino acid residues.The open reading frame of the cDNA was cloned into the plasmid pET-28b，which was then transformed into E.coil BL21(DE3)strain.The Mr of the expression product was 32 ku by SDS-PAGE.The recombinant E.coli BL21/pET28b-TLL exhibited highest activity of 41 U/mL at 28℃ for 7 h induction with 0.1 mmol/L IPTG after screening of the best medium.

Key wordslipase，Thermomyces lanuginosus，cloning，Escherichia coli，induction expression

Gene Cloning of Lipase from Thermomyces lanuginosus ZJB09222 and Expression in Escherichia coli

Lei Li-hua，Zheng Ren-chao，Liu Zhi-qiang，Li Xiao-jun，Zheng Yu-guo
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

碩士研究生(鄭裕國(guó)教授為通訊作者)。

2011-12-21，改回日期:2012-03-01