侯海波，羅惠波，黃治國，葉光斌

(四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢，643000)

濃香型白酒酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律*

侯海波，羅惠波，黃治國，葉光斌

(四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢，643000)

利用PCR-DGGE技術(shù)研究了濃香型白酒酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)及其發(fā)酵過程中的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有酒醅樣品均出現(xiàn)9～19條較清晰的條帶，其中第2、5、8、9、14、17號(hào)條帶在所有樣品中均有檢出，且優(yōu)勢度較高;所有樣品生物多樣性指數(shù)都在1.68～2.61之間。發(fā)酵前期，多樣性指數(shù)呈先下降后上升的趨勢，發(fā)酵至第21～49天基本保持平穩(wěn)，第56天時(shí)，多樣性指數(shù)到達(dá)最低值，第63天回升之后多樣性指數(shù)持續(xù)下降，發(fā)酵至第84天時(shí)略有回升;不同發(fā)酵時(shí)期酒醅真菌DGGE圖譜相似性指數(shù)較低，表明不同發(fā)酵時(shí)間酒醅樣品真菌群落間差異較大。

白酒酒醅，真菌，PCR-DGGE，18S rDNA，微生物群落

濃香型白酒的生產(chǎn)過程與微生物菌群的演化交替密不可分，窖池微生物經(jīng)過長期的馴化和發(fā)展，慢慢形成了獨(dú)特的微生物群落。酒醅富含豐富的微生物，除了細(xì)菌，古菌等原核微生物外，還有真核微生物，這些微生物的代謝產(chǎn)物是濃香型白酒酒體風(fēng)味與口感形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1］。因此，探討發(fā)酵過程中濃香型白酒酒醅微生物群落特性的差異及其變化規(guī)律，對(duì)濃香型白酒生產(chǎn)有著重要的指導(dǎo)意義。

前人采用平板培養(yǎng)，從酒醅中已分離出酵母屬、霉菌屬等真菌類群[2］。但是以形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)為基礎(chǔ)的真菌檢測和分類方法較為復(fù)雜，而且所得出的結(jié)論難免與實(shí)際情況有所偏差。近些年來分子生物學(xué)的方法越來越多地應(yīng)用于微生物群落的研究，有學(xué)者利用基因克隆研究酒醅真菌群落的多樣性[3］，也有學(xué)者利用PCR-SSCP探討濃香型大曲真核微生物群落的多樣性[4］，以及利用PCR-DGGE分析油脂廢水處理系統(tǒng)中酵母菌群落結(jié)構(gòu)等[5］，這些技術(shù)在真菌多樣性的研究中取得了可觀的成果。

本試驗(yàn)利用PCR-DGGE技術(shù)，研究發(fā)酵過程中酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律，為中國白酒生產(chǎn)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

酒醅樣品采自四川旭水酒業(yè)有限公司生產(chǎn)窖池中上位置(距窖壁1m，距窖頂0.5m)，迅速置于冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保藏。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司;去離子甲酰胺，德國AppliChem。

1.1.3 主要儀器

PCR儀，美國 BIO-RAD公司My cycle;DGGE電泳儀，美國 BIORAD公司，Dcode;高速冷凍離心機(jī)，德國Hettich公司，UNIVERSAL 32R;凝膠成像系統(tǒng)，美國 SIM公司，Bio-Best200E。

1.2 方法

1.2.1 酒醅微生物總DNA提取

用SDS-酚氯仿抽提法[6］提取酒醅微生物基因組DNA，然后用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度和純度，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

采用真菌通用引物 nu-SSU-0817-5’:5＇-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3＇和 nu-SSU-1196-3’-GC:5＇CCCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGCCGTCTGGACCTGGTGAAGTTTCC-3＇。擴(kuò)增18S rDNA 的 V6-V8 區(qū)[7］，引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成。

PCR 反應(yīng)體系為50 μL:1.0μL Taq酶(5U/μL)，5.0 μL 10× buffer，3.0 μL MgC12(25 mmol/L)，4.0 μL dNTPs Mixture(各 2.5 mmol/L)，引物(10 μmol/L)各 2.0 μL，2.0 μL 模板 DNA(100 ng/L)，31.0 μL滅菌雙蒸水。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性9 min;PCR循環(huán):95℃1min，48℃1 min，72℃1 min，一共35 個(gè)循環(huán);然后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染后拍照。

1.2.3 DGGE分析

在50 μL PCR 產(chǎn)物中加入8 μL6×loadding buffer混勻，取20 μL加入40%～55%(100%的變性劑中含有7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺)梯度變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度為38∶2)的加樣孔中，膠的規(guī)格為20 cm×20 cm，厚1 mm，在1×TAE電泳液中電泳，電泳溫度為60℃，先用200V電泳5 min，然后130 V電泳14h，銀染后拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

研究群落多樣性的方法很多，本研究主要用豐度(S)、優(yōu)勢度、樣品間相似性指數(shù)(Cs)和shannon-wiener指數(shù)(H)來表示。通過quantity one軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析。具體過程如下:

(1)豐度(S):用DGGE圖譜中條帶的個(gè)數(shù)表示。

(2)優(yōu)勢度:用某一特定條帶的峰面積占樣品總體峰面積的百分?jǐn)?shù)來表示。

(3)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)[8］:反映群落種類與均勻度的混合參數(shù)，即種類數(shù)目多，可增加多樣性;同樣，種類之間個(gè)體分配的均勻性增加也會(huì)使多樣性提高。

式中，H為Shannon-Wiener多樣性指標(biāo)值;pi為第i個(gè)物種所占的百分比，即是第i種的個(gè)體數(shù)與個(gè)體總數(shù)的比例;S為樣品中含有多少種不同的物種的數(shù)量，即該樣品總DGGE條帶數(shù)。

⑷相似性用索倫森配對(duì)相似性系數(shù)(Sorenson Pairwise Similarity Coefficient)[9］來計(jì)算:

式中，Cs為索倫森配對(duì)相似性系數(shù);a為某一樣品的PCR-DGGE圖譜的條帶數(shù)目;b為另一樣品的PCR-DGGE圖譜的條帶數(shù)目;j為2個(gè)泳道所共有條帶的數(shù)目。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 酒醅真菌18S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

酒醅樣品微生物總DNA光吸收比值OD260/OD280均在1.70～1.90之間。用引物nu-SSU-0817和nu-SSU-1196-GC擴(kuò)增酒醅真菌18S rDNA，得到460bp左右的片段(圖1)，符合引物設(shè)計(jì)的片段。

2.2 酒醅真菌18S rDNA PCR-DGGE圖譜

從酒醅真菌18S rDNA PCR-DGGE圖譜(圖2)中可以看出，所有樣品均出現(xiàn)9～19條較清晰的條帶，說明各樣品18S rDNA PCR產(chǎn)物通過DGGE得到了較好的分離。

圖1 酒醅細(xì)菌18S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 酒醅真菌群落DGGE圖譜

2.3 酒醅真菌DGGE圖譜豐度變化規(guī)律

本試驗(yàn)分析了DGGE圖譜中真菌豐度的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn):豐度總體上呈先下降后上升，而后保持平穩(wěn)，再下降的趨勢，后期基本平穩(wěn)。在發(fā)酵第1天時(shí)，豐度達(dá)到最大值19;在發(fā)酵第56天時(shí)，豐度值達(dá)到較低值，僅為9;到發(fā)酵第77，84天時(shí)，豐度值基本保持平穩(wěn)。

2.4 酒醅真菌DGGE圖譜條帶優(yōu)勢度變化規(guī)律

本試驗(yàn)分析了DGGE圖譜中主要條帶優(yōu)勢度的變化規(guī)律(表1、圖 3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):第 2、5、8、9、14、17號(hào)條帶在所有樣品中均有檢出，其中第2、5、8號(hào)條帶優(yōu)勢度隨著發(fā)酵時(shí)間的增加總體呈先下降后上升再下降并保持平穩(wěn)的變化趨勢，到發(fā)酵后期有波動(dòng);第2、5、8號(hào)條帶的優(yōu)勢度分別在發(fā)酵第70天，第77天，第84天達(dá)到最大值。9、14、17號(hào)條帶優(yōu)勢度隨著發(fā)酵時(shí)間的增加總體呈先上升后下降，再上升又下降最后上升的變化趨勢。第9、17號(hào)條帶的優(yōu)勢度變化趨勢較為相似，分別在發(fā)酵第21天，第70天達(dá)到最大值。第14號(hào)條帶的優(yōu)勢度在發(fā)酵第35天達(dá)到最大值;第3、6號(hào)條帶所代表的真菌類群，僅在發(fā)酵前期樣品中有檢出。第21、22號(hào)條帶所代表的真菌類群，只在發(fā)酵中后期酒醅樣品中有檢出。第20號(hào)條帶所代表的真菌類群，只在發(fā)酵中期酒醅樣品有檢出。

圖3 酒醅真菌群落條帶優(yōu)勢度變化規(guī)律

2.5 酒醅真菌DGGE圖譜多樣性指數(shù)變化規(guī)律

本試驗(yàn)分析了DGGE圖譜真菌群落多樣性指數(shù)的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn):酒醅樣品真菌多樣性指數(shù)都在1.68～2.61(圖4)。隨著發(fā)酵時(shí)間的開始，多樣性指數(shù)略呈先下降趨勢，發(fā)酵第21天時(shí)，多樣性指數(shù)開始回升，之后保持平穩(wěn)，發(fā)酵第42天時(shí)，多樣性指數(shù)達(dá)到最大值2.61。到第49天時(shí)，多樣性指數(shù)開始下降，發(fā)酵第56天時(shí)，多樣性指數(shù)達(dá)到最小值1.68，第63天回升后又持續(xù)下降，到發(fā)酵第84天時(shí)，多樣性指數(shù)略有回升。

圖4 酒醅真菌群落多樣性指數(shù)的變化規(guī)律

2.6 酒醅真菌DGGE圖譜相似性指數(shù)

本試驗(yàn)分析了酒醅真菌群指紋圖譜的相似性(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):發(fā)酵第21天和第28天的相似性指數(shù)為0.69，發(fā)酵第35天和第42天相似性指數(shù)為0.76，發(fā)酵第42天和第49天相似性指數(shù)為0.78，其他許多樣品間的相似性指數(shù)都在0.6以下?；谙嗨菩詳?shù)據(jù)，構(gòu)建UPGMA聚類圖(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵第35，42，49天聚為一大支，發(fā)酵第70，84天聚為一大支。

圖5 酒醅真菌群落UPGMA聚類圖

表2 不同發(fā)酵時(shí)期酒醅真菌群落相似性

3 討論

3.1 酒醅真菌DGGE圖譜豐度

生物多樣性研究中，豐度代表一定區(qū)域的物種數(shù)。DGGE將無法檢測DNA在基因組中的含量少于1.5%的種群，因此DGGE圖譜所反映的是樣品中的優(yōu)勢菌群[8］。邢德峰等[10］研究表明，當(dāng) DNA 片段為450～500 bp左右片段的，分類信息相對(duì)更為豐富。本試驗(yàn)采用真菌通用引物nu-SSU-0817-5’和nu-SSU-1196-3’-GC擴(kuò)增酒醅真菌18S rDNA，擴(kuò)增后的DNA片段為460 bp，所得的酒醅樣品真菌DGGE圖譜的豐度為9～19，實(shí)現(xiàn)了酒醅真菌的較好分離。研究結(jié)果表明:不同發(fā)酵時(shí)間樣品的條帶數(shù)差異較大，優(yōu)勢條帶在6～8條之間，其中既有所有樣品的共有條帶，也有部分樣品的共有條帶，還有個(gè)別樣品的特異條帶;隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，樣品條帶豐度總體上呈先下降，再上升，保持平穩(wěn)，再下降的趨勢，到發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定。

3.2 酒醅真菌DGGE圖譜條帶優(yōu)勢度

條帶的優(yōu)勢度反映的是該條帶的量在整個(gè)樣品中所占的比例大小[9］。對(duì)具有代表性的優(yōu)勢條帶的優(yōu)勢度分析，可在一定程度上代表酒醅細(xì)菌群落在發(fā)酵過程中演變情況。本試驗(yàn)分析了酒醅真菌DGGE圖譜的優(yōu)勢度，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在所有的酒醅樣品DGGE圖譜中，都檢出第 2、5、8、9、14、17 號(hào)6條共有條帶，且相對(duì)于其他條帶而言，優(yōu)勢度較高，說明這6條帶所代表的真菌類群，可能在窖池微生態(tài)系統(tǒng)中起重要的作用。其中第2、5、8號(hào)條帶的優(yōu)勢度變化趨勢在發(fā)酵前中期非常相似，后期都有波動(dòng);第9、17號(hào)條帶優(yōu)勢度的變化趨勢在發(fā)酵全過程中都較為相似。

3.3 酒醅真菌群落多樣性

生物多樣性是生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)，較高水平的生物多樣性有利于生態(tài)系統(tǒng)功能的發(fā)揮[11］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):酒醅真菌DGGE圖譜的H值為1.68～2.61。發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，真菌多樣性指數(shù)呈先遞減后上升的趨勢。這可能是由于在發(fā)酵過程中，發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇以及酸類物質(zhì)會(huì)在一定程度上影響真菌群落多樣性，多樣性指數(shù)在發(fā)酵第21～49天基本保持平穩(wěn)，在發(fā)酵第56天達(dá)到最小值，第63天略有回升后又持續(xù)下降，發(fā)酵后期厭氧環(huán)境的加劇以及營養(yǎng)關(guān)系的多樣化，都會(huì)在一定程度上影響到酒醅真菌群落的多樣性。第84天有所回升，這可能是由于發(fā)酵后期環(huán)境微生物遷移進(jìn)入酒醅中，使得酒醅微生物多樣性指數(shù)有所升高。

3.4 酒醅真菌群落相似性

相似性指數(shù)主要反映各樣品條帶數(shù)量之間的相似性關(guān)系，它是一個(gè)最基本的多樣性分析指數(shù)。王娜等[12］利用DGGE技術(shù)分析扇貝養(yǎng)殖海區(qū)真核浮游生物種群多樣性，發(fā)現(xiàn)月份相近的樣品中浮游生物微生物群落的相似性較好。施思等[13］利用PCR-DGGE技術(shù)分析盛夏習(xí)酒酒醅的微生物菌群結(jié)構(gòu)群落的相似性，發(fā)現(xiàn)入窖酒醅上下層及出窖酒醅上下層相似系數(shù)較高，菌群結(jié)構(gòu)差異不大，而入窖與出窖酒醅的相似系數(shù)較低，說明入窖與出窖酒醅菌群結(jié)構(gòu)已存在較大差異。本試驗(yàn)對(duì)微生物群落相似性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)窖池中上位置酒醅發(fā)酵過程中真菌群落間的相似性系數(shù)多數(shù)較低，在0.6以下，這表明在發(fā)酵過程中，不同發(fā)酵時(shí)間酒醅樣品真菌群落間存在一定的差異。

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ABSTRACTThe variational regularity of fungi community in fermentation process of fermented grains of luzhou-flavor liquor were analyzed by PCR-DGGE technique in the test.The results showed that 9～19 clear bands were shown clearly in these grains samples，wherein No.2，5，8，9，14，17 bands were significantly detected in all samples.The diversity index of these samples ranged from 1.68 to 2.61.At the early stage of fermentation，the diversity index of samples generally decreased at first and then followed by increasing.The diversity index was stable from Day 21 to Day 49 and reached the lowest value on Day 56.It increased at Day 63 and then decreased.It slightly rose on Day 84.The similarity indexes of PCR-DGGE patterns of samples from different stages were low，which indicated that the fungi community of Fermented Grains at different fermentation stage had some difference.

Key wordsliquor fermented grains，fungi，PCR-DGGE，18S rDNA，microflora

Fungi Community Structure and Variational Regularity of Fermented Grains of Luzhou-flavor Liquor

Hou Hai-bo，Luo Hui-bo，Huang Zhi-guo，Ye Guang-bin
(Liquor-making Biotechnology＆ Application Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science＆ Engineering，Zigong 643000，China)

在讀碩士研究生(羅惠波教授為通訊作者)。

*四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(No.07JY029-026);四川理工學(xué)院引進(jìn)人才項(xiàng)目(No.2007-18)

2011-11-25，改回日期:2012-03-21