彭英云，張濤，繆銘，沐萬孟，江波

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

2(鹽城工學(xué)院 化 學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽 城，224003)

一株非谷氨酸依賴型聚谷氨酸產(chǎn)生菌的篩選和鑒定*

彭英云1，2，張濤1，繆銘1，沐萬孟1，江波1

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

2(鹽城工學(xué)院 化 學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽 城，224003)

從土壤中分離到1株可不依賴谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的菌株SK19.001，通過16S rDNA序列比對并結(jié)合菌株的形態(tài)、生理生化特征分析，鑒定此菌株為甲基營養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)。在以甘油和蛋白胨F403為碳源和氮源的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，γ-PGA產(chǎn)量可達(dá)到14.57 g/L。

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，篩選，鑒定，甲基營養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)

γ-聚谷氨酸(Poly γ-Glutamate，γ-PGA)是一種多聚氨基酸類的環(huán)保型多功能生物可降解高分子材料，主要由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過酰胺鍵聚合而成。作為一種高分子聚合物，γ-PGA具有一些獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，如良好的水溶性，超強(qiáng)的吸附性，能徹底被生物降解，無毒無害，可食用等，可作為諸如保水劑、增稠劑、絮凝劑、重金屬吸附劑、藥物/肥料緩釋劑及藥物載體等的原料，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)保、合成纖維和涂膜等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

γ-PGA多由微生物發(fā)酵法得到，主要菌種為地衣芽孢桿菌屬和枯草芽孢桿菌屬[1］，也有報(bào)道從其它菌種如古生菌(archara)[2］、細(xì)菌(bacteria)[3］和真核生物(eucaryote)[4］發(fā)酵得到。根據(jù)細(xì)胞生長的營養(yǎng)要求是否需要谷氨酸，可以把γ-PGA產(chǎn)生菌分為兩大類:一種為谷氨酸依賴型[5］，如Bacillus licheniformis ATCC9945[6］，B.subtilis IFO3335[7］，B.subtilis F-2-01[8］等，另一種為非谷氨酸依賴型，如B.subtilis TAM-4[9］，B.licheniformis A35[10］。國內(nèi)學(xué)術(shù)界對前者的研究較多，有的菌株γ-PGA的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)基中谷氨酸含量的增加而增加[11］，有的則需要有谷氨酸作為啟動因子才會有γ-PGA的產(chǎn)生[12］。而對于非谷氨酸依賴型γ-PGA產(chǎn)生菌報(bào)道較少，從工業(yè)化角度考慮，篩選非谷氨酸依賴型γ-PGA產(chǎn)生菌株，利用廉價(jià)原料生產(chǎn)此種生物可降解高分子材料是非常必要的。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨5，NaCl，瓊脂15，pH7.0～7.2，37℃。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母提取粉25，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，pH 7.0～7.2，37℃，200 r/min 12 h。

篩選培養(yǎng)基(g/L):種子培養(yǎng)基+瓊脂15。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，蛋白胨15，酵母提取粉25，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO41，MnSO41 mmol/L，pH 7.0～7.2，37℃，200 r/min，12 h。

1.2 方法

1.2.1 篩選方法

土壤樣品以無菌去離子水浸泡，稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基固體平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，挑選生長快，高黏度的菌落做進(jìn)一步的篩選分離，將分離到的菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液中γ-PGA的含量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 細(xì)胞生長的測定

將培養(yǎng)液稀釋20倍后用752分光光度計(jì)讀取660 nm處吸光值A(chǔ)(660)。

1.2.2.2 發(fā)酵液黏度的測定

采用SNB-2數(shù)字式黏度儀室溫下測定發(fā)酵液的黏度。

1.2.2.3 γ-PGA的分離純化

發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后以10000 r/min，離心25 min去除菌體，制得發(fā)酵上清液，加入2～4倍體積的無水乙醇沉淀聚谷氨酸，輕微攪拌后于4℃靜置過夜，將聚谷氨酸沉淀以少量無水乙醇洗滌，用少量去離子水溶解，再次離心去除不溶物，經(jīng)透析除去鹽、糖等小分子，最后冷凍干燥，得到γ-聚谷氨酸。

1.2.2.4 γ-PGA的定性

通過水解液薄層層析法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)分析，將純化后的聚谷氨酸以6 mol/L HCl，110℃水解24 h，水解液以6 mol/L NaOH中和后以谷氨酸為對照分別用薄層層析法和高效液相色譜法分析其成分。

1.2.2.5 γ-PGA的測定

采用高效液相色譜法(HPLC)分析:將發(fā)酵液離心去除菌體后，取一定量以6 mol/L HCl，110℃水解過夜，分別用HPLC測定水解液和發(fā)酵液中游離谷氨酸的含量，兩者之差即為γ-PGA的產(chǎn)量。

1.2.2.6 菌種的鑒定與保藏

委托武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行鑒定與保藏。

1.2.3 不同碳、氮源對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在其它發(fā)酵條件相同的情況下，分別選取不同的碳源和氮源進(jìn)行培養(yǎng)，測定發(fā)酵液中γ-PGA的含量，確定SK19.001對碳源和氮源的利用情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 SK19.001菌株的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征

通過篩選和分離，從土壤樣品中得到1株產(chǎn)γ-聚谷氨酸的高黏菌落，編號為SK19.001，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號為CCTCC NO:M2011201)。SK19.001菌株在固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)有多樣性，當(dāng)培養(yǎng)基潮濕時(shí)，菌落濕潤、不透明，表面光滑呈“木耳狀”，中心有高黏液滴(圖1);干燥時(shí)，菌落粗糙皺褶，中央凹陷，邊緣不規(guī)則。

圖1 SK19.001的菌落形態(tài)

2.1.2 生理生化特征(表1)

表1 菌株SK19.001生理生化特性

2.1.3 遺傳學(xué)特征

經(jīng)過16S rRNA基因序列分析并將序列上傳Genbank做BLAST比較(基因登錄號為JQ723479)，利用Mega4.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)，其中同源性最高的為菌株Bacillus methylotrophicus P07(gb|JN700153.1)，同源性為100%，結(jié)合生理生化特征，將菌株SK19.001鑒定為甲基營養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)。

2.2 發(fā)酵水解產(chǎn)物的分析

按照1.2.2.4的方法對發(fā)酵和發(fā)酵水解產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析，以谷氨酸為對照，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，發(fā)酵產(chǎn)物水解后主要成分為谷氨酸，進(jìn)一步通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，水解產(chǎn)物出峰單一且出峰時(shí)間與谷氨酸一致(圖4和圖5)，由此可以斷定發(fā)酵產(chǎn)物為聚谷氨酸。

2.3 對碳源的利用

分別選取葡萄糖、甘油、谷氨酸鈉、可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、蔗糖、檸檬酸、果糖為碳源，濃度各為30 g/L，其余培養(yǎng)基成分為(g/L):酵母提取粉50、MgSO4·7H2O 0.6、K2HPO41、MnSO41 mmol/L，pH 7.0～7.2，37℃，200 r/min，24 h。結(jié)果見表2。

圖2 SK19.001菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖3 發(fā)酵水解產(chǎn)物層析圖

圖4 谷氨酸標(biāo)樣的HPLC圖譜

圖5 發(fā)酵水解產(chǎn)物的HPLC圖譜

表2 碳源對SK19.001產(chǎn)γ-PGA的影響

從表2中可以看出，與其它聚谷氨酸產(chǎn)生菌不同的是，甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK19.001可利用的碳源非常廣泛，對選取的每種碳源都可利用并產(chǎn)生PGA，說明它是1株可不依賴谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)聚谷氨酸的菌株，在已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)中，除了B.subtilis TAM-4[9］，B.licheniformis A35[10］以外，其余產(chǎn)聚谷氨酸的菌株大都需要谷氨酸的存在，如Jung等人[11］對1株Bacillus sp.RKY3的研究表明，培養(yǎng)基如不添加谷氨酸則沒有γ-PGA的生成。

2.4 對氮源的利用

分別選取魚粉蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母提取粉、蛋白胨(動物)、蛋白胨F403、玉米漿粉、大豆蛋白胨、NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、脲素作為氮源，含氮量為5 g/L，其余培養(yǎng)基為(g/L):甘油30，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO41，MnSO41 mmol/L，pH 7.0～7.2，37℃，200 r/min，24 h。結(jié)果見表3。

從表3可以看出，甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK19.001主要利用有機(jī)氮源產(chǎn)聚谷氨酸，無機(jī)氮源幾乎不利用，有別于B.subtilis TAM-4[9］、B.subtilis PGA-O-7[13］可利用無機(jī)氮源產(chǎn)γ-PGA;在有機(jī)氮源中，酵母提取粉、玉米漿粉、蛋白胨(動物)和蛋白胨F403產(chǎn)γ-PGA較高，而不同來源的蛋白胨對SK19.001產(chǎn)γ-PGA的影響較大，表現(xiàn)為對魚粉蛋白胨幾乎不利用;而對動物蛋白胨和蛋白胨F403利用率較高。此外，對γ-PGA黏度的測定表明，發(fā)酵液黏度與產(chǎn)量有一定的相關(guān)性，即有γ-PGA產(chǎn)生的發(fā)酵液都具有一定的黏度，但并不是黏度越高產(chǎn)量越高，有時(shí)可能因?yàn)榘l(fā)酵液氣泡的影響而使得黏度測定值偏高。

表3 氮源對SK19.001產(chǎn)γ-PGA的影響

3 結(jié)果與討論

通過篩選和鑒定，從土壤中得到1株可不依賴谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的甲基營養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)，這是除枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌[14］外的1株新的產(chǎn)γ-PGA的芽孢桿菌種屬。通過對碳源和氮源的篩選，SK19.001對碳源的利用范圍非常廣泛，而對氮源則有一定的選擇性。

國內(nèi)外對谷氨酸依賴型菌株研究較多，但從生產(chǎn)原料角度考慮，不需谷氨酸作為發(fā)酵底物的菌株具有成本上的優(yōu)勢，更具有工業(yè)化應(yīng)用前景。目前國內(nèi)對此類菌株的研究還較少，產(chǎn)量也不高(Bacillus subtilis PGA-O-7:2.8 mg/mL[13］;Bacillus licheniformis PGAN:11 mg/mL[15］;Bacillus amyloliquefaciens LL3:4.36 g/L[14］)，SK19.001在碳氮源簡單篩選的情況下可產(chǎn)出γ-PGA 14.57 g/L，因此如進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，研究代謝過程中各種因素對γ-PGA積累的影響，γ-PGA的產(chǎn)出水平還有較大的提高空間。

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ABSTRACTA strain SK19.001 which could produce poly γ-glutamate(γ-PGA)independent of glutamic acid in culture was isolated.It was identified as Bacillus methylotrophicus based on the sequence analysis of 16S rDNA and a series of morphological and biochemical characteristics.The yield of γ-PGA was 14.57 g/L when the strain was grown in glycerol and peptone F403-containing medium at 37℃for 24 h with shaking.

Key wordspoly γ-glutamate(γ-PGA)，screening，identification，Bacillus methylotrophicus

Screening and Identification of a Glutamate-independent Poly γ-glutamate Produced Strain

Peng Ying-yun1，2，Zhang Tao1，Miao Ming1，Mu Wan-meng1，Jiang Bo1
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224003，China)

在讀博士(江波教授為通訊作者)。

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20976073，31000764);江蘇省國際合作項(xiàng)目(BZ2011026)。

2012-03-20，改回日期:2012-05-22