魏丹，竇文芳，李恒，李會，許正宏，，史勁松

1(江南大學 醫(yī)藥學院，江蘇 無 錫，214122)

2(江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

高效降解褐藻膠新菌種的篩選、鑒定及產酶條件優(yōu)化*

魏丹2，竇文芳1，李恒1，李會1，許正宏1，2，史勁松1

1(江南大學 醫(yī)藥學院，江蘇 無 錫，214122)

2(江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

以褐藻酸鈉為唯一碳源，從腐爛的海帶中篩選出1株高效降解褐藻膠的菌株，根據其形態(tài)學特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鑒定該菌株屬于白蟻菌屬(Isoptericola)，命名為嗜鹽白蟻菌WX(Isoptericola halotolerans WX)。菌株WX的最佳培養(yǎng)基組成為:褐藻酸鈉6 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉2.5 g/L、NaCl 25 g/L、MgSO42 mmol/L、CaCl20.5 mmol/L、KH2PO41 mmol/L、FeSO40.2 mmol/L、MnSO40.3 mmol/L;搖瓶最佳培養(yǎng)條件為:250 mL三角瓶裝瓶量50 mL，pH 8.0，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉速180 r/min，培養(yǎng)時間44 h。2 mmol/L Mg2+和0.2 mmol/L Fe2+對酶活力有明顯的促進作用。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，褐藻膠裂解酶活力達到432 U/mL，較優(yōu)化前提高了13倍。此外，嗜鹽白蟻菌WX同時具有淀粉酶和褐藻膠裂解酶活性，具有廣泛的應用前景。

褐藻膠裂解酶，嗜鹽白蟻菌，褐藻寡糖，篩選，產酶條件優(yōu)化，淀粉酶

褐藻膠是一種酸性多糖，為β-D-甘露糖醛酸(β-D-1，4-mannuronic acid，簡稱M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-1，4-guluronicacid，簡稱G)以C-1，4糖苷鍵非均聚形成的線性分子，無分支和側鏈，相對分子質量可達3.2萬～18.6萬[1］。褐藻寡糖是褐藻膠的降解產物，具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化作用，還能夠促進多種植物的根部生長，起到延長植物生命周期的作用。褐藻膠裂解酶可通過β-消去反應降解褐藻膠，并在非還原性末端C 4，5之間形成不飽和雙鍵[2］，是褐藻寡糖的酶法制備的主要途徑。

根據底物專一性，褐藻膠裂解酶可分為聚甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和聚古羅糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)[3］兩種類型。目前已發(fā)現50多種褐藻膠裂解酶，主要來源于海洋藻類、軟體動物、海洋細菌、陸生真菌及少數噬菌體和病毒[4-7］，通過富集褐藻附生菌并進行篩選可以獲得產酶菌株，但大多數菌株產酶水平較低，如不動桿菌X8、Microbulbifer species 6532A和Bacillus amyloliquefaciens所產褐藻膠裂解酶分別為157.3 U/mL、114.8 U/mL和6.48 U/mL(紫外法)[8-10］，而且這些酶受底物專一性影響，對褐藻膠的降解位點較少，是酶法制備褐藻寡糖的主要限制因素。因此，篩選高效降解褐藻膠新菌種，尋找適合褐藻寡糖生產的特異性褐藻膠裂解酶對開發(fā)褐藻膠資源，探索高值化利用新途徑，擴大褐藻寡糖在藥品、功能食品、植物生長調節(jié)劑等領域的應用具有十分迫切的意義。

本研究從腐爛的海帶中篩選得到1株具有低底物專一性、高褐藻膠裂解酶活力的菌株，通過形態(tài)學特征、生理生化特性、16S rDNA基因序列分析進行菌種鑒定，并對其產酶條件進行初步探索，為酶學性質研究及褐藻寡糖的酶法制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

腐爛的海帶，采自于連云港中大海藻工業(yè)有限公司，4℃密閉保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)富集培養(yǎng)基與初篩培養(yǎng)基(g/L):(NH4)2SO45，K2HPO42，NaCl 30，MgSO4·7H201，FeSO4·7H2O 0.01，褐藻酸鈉5，瓊脂15，pH 7.5。

(2)種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨5，酵母提取物1，褐藻酸鈉5，NaCl 30，pH 7.5。

1.2 產褐藻膠裂解酶菌株的篩選

將連續(xù)馴化5代的培養(yǎng)液用無菌生理鹽水按照10-5到10-10進行梯度稀釋，吸取0.1 mL的稀釋液涂布到初篩培養(yǎng)基平板上。28℃恒溫培養(yǎng)72 h后，觀察菌落形態(tài)，選取生長良好且具有透明水解圈的菌株，接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵上清液中的酶活力。

1.3 褐藻膠裂解酶的活力測定方法

改良的DNS(3，5-二硝基水楊酸)法:由于褐藻酸鈉的熱不穩(wěn)定性，對DNS法進行適當改良。取0.1 mL酶液加入1 mL 1%褐藻酸鈉溶液(0.05 mol/L、pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制)中，40℃反應20 min后，加入1 mL DNS溶液，沸水浴反應3 min，迅速冷卻后定容至10 mL，用紫外分光光度計于520 nm下測定吸光值。

1個酶活力單位(U)定義為:1 mL酶液在上述條件下，每分鐘產生1 μg還原糖所需要的酶量。

1.4 菌株WX的鑒定

1.4.1 形態(tài)學特征與生理生化特征鑒定

將菌株WX涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)48 h，觀察細胞形態(tài)和菌落特征。部分生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》。

1.4.216S rDNA鑒定[11］

利用通用引物[12］對菌株WX進行16S rDNA基因序列的擴增。將克隆后的樣品送至上海生工生物技術公司進行測序。測序結果在GenBank中進行BLAST序列比對，確定種屬。遵循鄰接法和最大相似法原則，應用CLUSTAL、MEGA4.0等軟件進行聚類分析與同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 產酶條件的優(yōu)化

在250 mL三角瓶中裝入20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按2%(體積分數)接種種子液，于28℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h后測定褐藻膠裂解酶酶活力。所有實驗均設3個平行。前一步優(yōu)化結果用于后續(xù)實驗。

2 結果與分析

2.1 褐藻膠降解菌株的篩選

通過富集培養(yǎng)，從腐爛的海帶中篩選出10株能在以0.5%(w/v)褐藻酸鈉為唯一碳源的平板上生長且形成透明水解圈的菌株，大部分為細菌。根據Hc值(透明圈直徑/菌落直徑)能夠初步判斷褐藻膠裂解酶活力的大小。挑選Hc＞2的10株菌株進行搖瓶復篩，對其產酶能力進行比較，結果表明，菌株WX發(fā)酵液酶活力最高，并且經5代遺傳穩(wěn)定性培養(yǎng)證明該菌株的產酶能力較穩(wěn)定，故作為下一步繼續(xù)研究的菌株。

2.2 菌株WX鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征

菌株WX在初篩平板上培養(yǎng)48 h后，菌落呈圓形，黃色，不透明，表面濕潤光滑。菌株WX為短桿狀或近似球形，無鞭毛，無孢子，有莢膜(圖1)，革蘭氏染色陽性。

圖1 菌株WX的透射電鏡圖

2.2.2 生理生化特性

菌株WX可在20～40℃，pH 5.5～11.0的條件下生長，最適溫度為25℃，最適pH為8.0。最高能夠耐受30%的NaCl，在含有4%的NaCl中生長最旺盛。其余生理生化特性如表1所示。白蟻菌DSM 10177T(Isoptericola variabile DSM 10177T)[13］是白蟻菌屬(Isoptericola)唯一的一個有效種。比較兩者生理生化特征，基本相同，進一步驗證菌株WX屬于白蟻菌屬。但在利用果糖、甘露醇及MR實驗存在差異性，表明菌株WX可能是白蟻菌屬潛在的一個新種。

表1 嗜鹽白蟻菌WX與嗜鹽白蟻菌DSM 10177T生理生化特征比較

2.2.316S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

測序得到菌株WX的16S rDNA基因序列含有1481 bp(GenBank登錄號:JQ288840)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明(圖2)，菌株WX與Isoptericola halotolerans(AB489222)親緣關系最近，16S rDNA序列相似性為100%。同時結合菌株的形態(tài)學特征和生理生化特性，將其歸類為白蟻菌屬(Isoptericola)，命名為嗜鹽白蟻菌WX(Isoptericola halotolerans WX)。

圖2 菌株WX的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

嗜鹽白蟻菌屬隸屬于放線菌(Actinobacteria)，是Stackebrandt等[14］近期才提議成立的一個新屬。到目前為止，該屬只包含了唯一的一個有效種I.variabile DSM 10177T。Zhang等[13］從青海分離了1株嗜鹽白蟻菌I.halotolerans YIM 70177T，并對其特性進行了初步研究。而通過生理生化特征比較，本文所篩選的嗜鹽白蟻菌WX(I.halotolerans WX)與白蟻菌DSM 10177T(I.variabile DSM 10177T)存在一定差異，表明菌株WX可能是白蟻菌屬潛在的一個新種，但仍需要根據這兩株菌株的細胞化學組成分析及基因組DNA-DNA的雜交結果來定論。

2.3 產酶條件優(yōu)化

2.3.1 碳源對產酶的影響

主要研究了果糖、乳糖、褐藻酸鈉、麥芽糖、淀粉、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘油、山梨醇分別作為碳源時對菌株WX的產酶情況的影響。結果表明，只有以褐藻酸鈉為唯一碳源時，褐藻膠裂解酶才具有降解活性。因此可以推測菌株WX所產的褐藻膠裂解酶為誘導酶。據文獻報道，大多數褐藻膠裂解酶均屬于誘導酶[15］。在此基礎上，進一步研究了不同濃度的褐藻酸鈉對菌株WX產酶的影響。圖3表明，當褐藻酸鈉濃度為0.6%時，褐藻膠裂解酶活性最高。原因可能是培養(yǎng)基的黏度增加影響菌株產酶，也可能是作為唯一碳源的褐藻酸鈉雖然是誘導菌株WX分泌褐藻膠裂解酶的必要誘導物，但底物濃度過高可能會影響該菌株的正常代謝。

2.3.2 氮源對產酶的影響

圖3 褐藻酸鈉濃度對菌株WX菌體濃度和產酶的影響

氮源是微生物生長和代謝所需營養(yǎng)物質的重要來源，也是構成酶的重要成分。本文選取了0.5%(w/v)的無機氮源、有機氮源與復合氮源進行比較(圖4)。結果顯示，嗜鹽白蟻菌WX能在多種氮源條件下生長，但在無機氮源(硫酸銨、氯化銨、草酸銨)中生長緩慢，未檢測到酶活。而在有機氮源中同時具有較高的生物量和酶活，其中酵母粉與蛋白胨為最佳組合氮源，最適配比為5 g/L和2.5 g/L。復合氮源不僅能較好的促進菌體的生長，更有益于產酶能力的提升，推測可能原因是蛋白胨、酵母粉等有機氮源經酶、酸、堿水解后獲得的胨、肽、氨基酸等組成的水溶性混合物，更容易被菌株分解利用，從而促進菌株生長[16］。

圖4 蛋白胨與酵母粉濃度對菌株WX生長和產酶的影響

表2 不同氮源對菌株產酶的影響

2.3.3 NaCl及金屬離子對產酶的影響

在以上工作基礎上，考察了不同濃度NaCl(0～4%)對菌株WX產酶的影響(圖5)。不同濃度的NaCl對菌株WX的生長和產酶均有顯著的促進作用，這可能與該菌株原生環(huán)境密切有關，菌株WX產酶的最適NaCl濃度為25 g/L。不同種類的金屬離子對菌株WX的生長影響不明顯，其對產酶能力的影響見表3。結果表明，當Mg2+、Fe2+的添加濃度分別為2 mmol/L和0.2 mmol/L時，褐藻膠裂解酶的酶活力提高近1倍;而Fe3+、Cu2+、Zn2+表現為抑制作用(圖6)。

表3 不同金屬離子對菌株WX產酶的影響

圖5 NaCl濃度對菌株WX菌體濃度和產酶的影響

圖6 金屬離子對菌株WX產酶的影響

實驗發(fā)現，NaCl對菌株WX所產的褐藻膠裂解酶具有重要作用。當培養(yǎng)基中不含有NaCl時，菌株WX幾乎不產酶。另外實驗中發(fā)現，分離純化后的褐藻膠裂解酶在NaCl不存在時也表現出一定活性，因而推測NaCl可能是菌株WX合成褐藻膠裂解酶途徑中的必需物，或是通過改變細胞膜的通透性影響了該酶的分泌。具體原因還需后續(xù)實驗探索。此外，NaCl及一些金屬離子對褐藻膠裂解酶具有明顯地促進作用，使其酶活力提高了近1.5倍。原因可能是NaCl及金屬離子可以破壞底物周圍的水分子，使酶與底物充分結合;也可能是其能夠影響酶與底物結合時的電荷，使之形成更穩(wěn)定的酶與底物復合物[17］。

2.3.4 培養(yǎng)基初始pH對產酶的影響

培養(yǎng)基初始的pH值直接影響著菌體細胞的通透性、穩(wěn)定性以及代謝產物酶系的活性，而且通過影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的離子化程度，間接影響著微生物對營養(yǎng)物質的吸收。如圖7所示，菌株WX生長、產酶最適pH為8.0，這與已報道的海洋細菌來源的褐藻膠裂解酶的適宜pH均為6～8相一致[18］。說明該菌株適合在偏堿環(huán)境下生長、產酶，酸性條件易使酶的結構發(fā)生變化，從而影響裂解酶的活力。該結果也與氮源的利用相符合。微生物利用無機氮源時，體系pH往往是降低的，而復雜氮源能夠緩沖體系的pH變化，為菌體生長、產酶創(chuàng)造良好的環(huán)境。

圖7 pH值對菌株WX菌體濃度和產酶的影響

2.3.5 培養(yǎng)溫度、裝液量和搖床轉速對產酶的影響

菌體細胞的生長是由一系列嚴格有序的生化反應所組成，而生化反應受溫度影響較大，故溫度對菌體細胞的生長和產酶具有顯著的影響。將菌株WX在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃下進行發(fā)酵培養(yǎng)，其產酶結果顯示，菌株WX最佳培養(yǎng)溫度為25℃。先前的研究也表明，大多數褐藻膠降解菌產酶的適宜溫度范圍為25～30℃。

裝液量也是制約菌種生長及產酶的一個重要因素。裝瓶量過少，水分容易揮發(fā)，過大則溶氧降低，影響菌體生長，導致產酶下降。于250 mL三角燒瓶中分別加入10、20、35、50、65、80、95、110 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，考察裝液量對菌株WX產酶的影響。實驗結果表明，裝液量為50 mL時，褐藻膠裂解酶活力最高，說明該菌株對通氣量要求不是十分嚴格。

試驗還測定了不同搖瓶轉速(150 r/min、180 r/min、210 r/min、240 r/min)對菌株WX產酶的影響。結果顯示搖瓶轉速對菌株WX生長及產酶作用不明顯，適宜轉速為150～180 r/min。

2.4 菌株WX的發(fā)酵產酶曲線

在最佳培養(yǎng)基和最適條件下，考察了菌株WX的發(fā)酵產酶情況(圖8)。分析圖8可知，菌株WX生物量在于40 h達到最大，發(fā)酵液中酶活力于44 h達到最高，為432 U/mL，即菌株發(fā)酵產酶的最高點出現在菌體生長的穩(wěn)定期之后，產酶與生長表現出一定的偶聯性，但在時間上略微滯后。故所產的褐藻膠裂解酶屬于生長半偶聯型，即酶合成伴隨細胞生長而開始，但在細胞生長進入穩(wěn)定期后酶仍可以延續(xù)合成一段較長時間。此類酶的合成不受產物的反饋抑制或分解代謝物的阻遏，所對應的mRNA較穩(wěn)定[19］，為褐藻膠裂解酶的工業(yè)化生產提供了可能。

圖8 菌株WX的生長曲線和產酶曲線

另外，通過透明圈實驗發(fā)現，菌株WX可以產生淀粉酶催化淀粉水解，說明該菌株具有淀粉酶活性，是否具有其他生物酶活性尚在研究中。劉妍等[20］已在澳大利亞厚皮海綿中篩選出了21株具有多重生物酶活性，同時具有褐藻膠裂解酶和淀粉酶活性。此外，實驗發(fā)現，嗜鹽白蟻菌WX所產的褐藻膠裂解酶為雙功能酶，既可以降解聚古羅糖醛酸嵌段，又可以降解聚甘露糖醛酸嵌段，但更易作用于難于降解的聚古羅糖醛酸嵌段。目前，只有少數菌株可以產生雙功能的褐藻膠裂解酶，此酶的發(fā)現無疑為生產具有生物活性的低聚合度褐藻寡糖提供了可能。因此，這株隸屬于放線菌的嗜鹽白蟻菌WX(I.halotolerans WX)具有極大的潛在開發(fā)和應用價值。

3 結論

(1)本文從腐爛的海帶中篩選出1株稀有菌株WX，經形態(tài)學特征、生理生化特征和分子鑒定將其歸為白蟻菌屬，命名為嗜鹽白蟻菌WX(Isoptericola halotolerans WX)。目前，褐藻膠裂解酶主要來源于假單胞菌、弧菌、固氮菌等，尚未有白蟻菌屬分泌該酶的報道。同時，本文在國內外首次報道了產褐藻膠裂解酶的白蟻菌屬(Isoptericola)菌株的選育。

(2)產酶優(yōu)化實驗表明，嗜鹽白蟻菌WX的最佳培養(yǎng)基組成為:褐藻酸鈉6 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉2.5 g/L、NaCl 25 g/L、MgSO42 mmol/L、CaCl20.5 mmol/L、KH2PO41 mmol/L、FeSO40.2 mmol/L、Mn-SO40.3 mmol/L;搖瓶最佳培養(yǎng)條件為250 mL三角瓶裝瓶量50 mL，pH 8.0，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉速180 r/min，培養(yǎng)時間44 h。

(3)嗜鹽白蟻菌WX具有產酶時間短、生長速度快的特點，且所產褐藻膠裂解酶具有較高活性(432 U/mL)，是規(guī)?；a褐藻寡糖的優(yōu)勢菌株。該酶屬于生長半偶聯型，可以通過延長菌株生長周期、提高菌體量進一步提高酶活性。此外，該酶的雙功能性和雙重酶活性大大提升了該菌株的應用價值，對其研究具有一定意義。

[1]Gacesa P.Enzyme Degradation of Alginates[J］.International Journal of Biochemistry，1992，24(4):545-552.

[2]Wong TY，Preston LA，Schiller NL.Alginate lyase:Review of Major Sources and Enzyme Characteristics，Structure-Function Analysis，Biological Roles，and Applications[J］.Annual Review of Microbiology，2000，54:289-340.

[3]Sawabe T，Ohtsuka M，Ezura Y.Novel alginate lyases from marine bacterium Alteromonas sp.strain H-4[J］.Carbohydrate Research，1997，304(1):69-76.

[4]Sim SJ，Baik KS，Park SC，et al.Characterization of alginate lyase gene using a metagenomic library constructed from the gut microflora of abalone[J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2011，39(4):585-593.

[5]Li LY，Jiang XL，Guan HS，et al.Three Alginate Lyases from Marine Bacterium Pseudomonas fluorescens HZJ216:Purification and Characterization[J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，164(3):305-317.

[6]Hu X，Jiang X，Hwang HM.Purification and characterization of an alginate lyase from marine bacterium Vibrio sp.mutant strain 510-64[J］.Current Microbiology，2006，53(2):135-140.

[7]Kim DE，Lee EY，Kim HS.Cloning and characterization of alginate lyase from a marine bacterium Streptomyces sp.ALG-5[J］.Marine Biotechnology，2009，11(1):10-16.

[8]侯保兵，劉書來，張建友，等.褐藻膠裂解酶產生菌的發(fā)酵優(yōu)化研究[J］.水產科學，2009，28(11):667-670.

[9]劉玉佩，汪立平，趙勇，等.解淀粉芽孢桿菌產褐藻膠裂解酶的發(fā)酵條件優(yōu)化[J］.湖南農業(yè)科學，2010，5(23):17-20.

[10]Wakabayashi M，Sakatoku A，Noda F，et al.Isolation and characterization of Microbulbifer species 6532A degrading seaweed thalli to single cell detritus particles[J］.Biodegradation，2011，23(1):93-105.

[11]Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J］.Journal of Bacteriology，1991，173(2):697-703.

[12]Cello FD，Bevivino A，Chiarini L，et al.Biodiversity of a Burkholderia cepacia Population Isolated from the Maize Rhizosphere at Different Plant Growth Stages[J］.Applied and Environment Microbiology，1997，63(11):4485-4493.

[13]Zhang YQ，Schumann P，Li WJ，et al.Isoptericola halotolerans sp.nov.，a novel actinobacterium isolated from saline soil from Qinghai Province，north-west China[J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55(5):1867-1870.

[14]Stackebrandt E，Schumann P，Cui XL.Reclassification of Cellulosimicrobium variabile Bakalidou et al.2002 as Isoptericola variabilis gen.nov.，comb，nov.[J］.International Journa of Systematic and Evoutionary Microbiology，2004，54(3):685-688.

[15]Momma K，Okamoto M，Mishima Y，et al.A novel bacterial ATP-binding cassette transporter system that allows uptake of macromolecules[J］.Journal of Bacteriology，2000，182(14):3998-4004.

[16］張寧寧.褐藻酸降解菌株S3的篩選分離及培養(yǎng)條件和產酶能力[J］.東北林業(yè)大學學報，2010，38(10):106-108.

[17]馬悅欣，紀濤，李慧瓊，等.假交替單胞菌LJ1菌株產褐藻膠裂解酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化及酶學性質[J］.微生物學報，2009，49(8):1086-1094.

[18]李麗妍，管華詩，江曉路，等.海藻工具酶——褐藻膠裂解酶研究進展[J］.生物工程學報，2011，27(6):838-845.

[19]郭勇.酶工程[M］.第三版.北京:科學出版社，2009:116-120.

[20]劉妍，李志勇.具有多重酶活性的澳大利亞厚皮海綿共附生放線菌的研究[J］.生物技術通報，2006(5):121-125.

ABSTRACTA high efficient novel alginate-degrading microorganism was isolated from rotten seaweed using sodium alginate as the sole carbon source.Based on the morphological，physiological characteristics and 16S rDNA sequence，the strain was identified as Isoptericola halotolerans WX.The optimized fermentation medium was composed of sodium alginate 6.0 g/L，tryptone 5.0 g/L，yeast extract 2.5 g/L，NaCl 25.0 g/L，MgSO42 mmol/L，CaCl20.5 mmol/L，KH2PO41 mmol/L，FeSO40.2 mmol/L，and MnSO40.3 mmol/L.The optimal culture condition was that the strain was cultured in 250 mL shake flasks containing 20 mL medium with shaking speed of 180 r/min and initial pH 8.0 at 25℃for 44 h.Besides，2 mmol/L Mg2+and 0.2 mmol/L Fe2+had remarkable effect on enzyme activity.Under the optimized conditions，the activity of alginate lyase was increased significantly from 32 U/mL to 432 U/mL，around 13-fold compared with the state without optimization.Additionally，Isoptericola halotolerans WX was demonstrated to possess the activity of amylase，which confers its extensive potential applications.

Key wordsalginate lyase，Isoptericola halotolerans，alginate oligosaccharides，isolation，fermentation optimization，amylase

Isolation，Identification，and Fermentation Optimization of a High Efficient Novel Alginate-degrading Strain

Wei Dan2，Dou Wen-fang1，Li Heng1，Li Hui1，Xu Zheng-hong，Shi Jin-song1
1(School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangna University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(史勁松教授為通訊作者，E-mail:shijs@163.com)。

*十二五國家科技支撐計劃項目(2012BAD33B06)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(JUSRP31101)，江蘇省自然科學基金(BK2009065)

2012-03-22，改回日期:2012-05-04