王金，蔡謹，施周銘，黃磊，徐志南

(浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江杭州，310027)

以木薯渣水解液為碳源固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸工藝的研究*

王金，蔡謹，施周銘，黃磊，徐志南

(浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江杭州，310027)

利用廉價的非糧原料及采用新型高效的固定化發(fā)酵技術(shù)對于實現(xiàn)丁酸的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。文中研究了纖維床生物反應(yīng)器組成形式對固定化酪丁酸梭菌產(chǎn)丁酸過程的影響，結(jié)果表明，采用纖維床生物反應(yīng)器四柱并聯(lián)發(fā)酵時，丁酸終濃度比單柱發(fā)酵提高7.19%，尤其是產(chǎn)率提高了136.7%。以木薯渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應(yīng)器四柱并聯(lián)進行丁酸批次發(fā)酵和補料發(fā)酵。批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸濃度達到25.2 g/L，得率0.46 g/g，采用補料發(fā)酵，丁酸終濃度可達61.4 g/L。

固定化發(fā)酵，木薯渣水解液，丁酸，補料發(fā)酵

丁酸是一種重要的短鏈脂肪酸，在食品、化工、醫(yī)藥等方面有重要的應(yīng)用[1］。以其為前體生產(chǎn)的脂類可以用作食品添加劑來增加食物的香味。丁酸還能用于醫(yī)藥中間體的制備，如(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的重要中間體，可用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾病。此外，丁酸鈉鹽還可作為替代抗生素的飼料添加劑飼喂家禽，以促進生長。

目前，丁酸的工業(yè)生產(chǎn)以化學合成法為主，其中以間歇式丁醛氧化法[2］最為普遍，但其工藝復雜，環(huán)境污染嚴重。隨著化石性資源日漸枯竭，傳統(tǒng)化工造成環(huán)境污染以及人們對生物基化學品需求的快速增加，化學工業(yè)呈現(xiàn)出從石油基到生物基的轉(zhuǎn)變趨勢。另外，由于丁酸和下游衍生產(chǎn)品有相當比例應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥等行業(yè)，從生物質(zhì)出發(fā)經(jīng)生物合成的丁酸(即生物丁酸)更受歡迎。目前，相關(guān)的研究僅限于實驗室，尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。其中主要問題是生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸存在原料成本高、單位體積產(chǎn)量低和生產(chǎn)效率低等缺點，使其始終無法替代化學合成法。因此，研究人員一方面需要尋找和利用廉價的基質(zhì)原料，另一方面需要探索高效穩(wěn)定的發(fā)酵工藝。

為了降低發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸的成本，研究者曾嘗試利用各種廉價原料和廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，如乳清[3］、玉米芯水解液[4］、玉米粉以及廢糖蜜[5］等。木薯渣是木薯提取淀粉后的廢棄物。目前全國每年產(chǎn)生的木薯渣為30萬t左右，除少量被用作飼料外，大量被廢棄，不僅造成資源浪費，還帶來環(huán)境污染問題。雖然以木薯淀粉及其水解物為發(fā)酵底物的研究很多[6-8］，但利用木薯渣水解液作為發(fā)酵底物的研究[9-11］較少。

利用纖維床生物反應(yīng)器[12］固定化發(fā)酵有利于提高發(fā)酵的產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)效率。但是，目前這種反應(yīng)器的應(yīng)用僅限于實驗室小規(guī)模，且單個使用，發(fā)酵周期相對較長。

本文針對以上兩個問題，研究了多柱式纖維床生物反應(yīng)器固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的可行性，并探索了以木薯渣水解液為碳源多柱式纖維床生物反應(yīng)器固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum ZJU8235)，由浙江大學生物工程研究所選育和保藏。

葡萄糖，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;硫酸銨、磷酸氫二鉀、鹽酸半胱氨酸鹽、硫酸亞鐵，上海生工生物工程有限公司;刃天青，Sigma公司;酵母粉、蛋白胨，BBI公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋、HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;AnkeTGC-16C離心機，上海安亭科學儀器廠;YQX-II厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠;5L體系發(fā)酵罐，德國B-Braun公司;6820氣相色譜儀系統(tǒng)，Agilent Technology公司;紫外/可見分光光度計，Amershan Biosciences公司;AL104電子天平MP120-BLE便攜式酸度計，Mett-ler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木薯渣的預處理

在高壓蒸汽(121℃)條件下，木薯渣與0.3 mol/L H2SO4固液比1∶10，水解反應(yīng)30 min。將得到水解反應(yīng)液調(diào)pH至6.0，過濾得濾液，測定其還原糖含量。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制

種子培養(yǎng)基(1 L):30 g葡萄糖，5 g酵母粉，5 g蛋白胨，3 g(NH4)SO4，1.5 g K2HPO4，0.6 g Mg2SO4，0.03 g FeSO4，0.3 g半胱氨酸-HCl(作為還原劑)，0.5 mL 0.1%刃天青(作為無氧指示劑)，在沸水浴中煮沸除氧，培養(yǎng)基在121℃下滅菌30 min。培養(yǎng)條件為37℃，pH6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為60 g/L葡萄糖或者木薯渣水解液，其它成分與種子液相同。充氮氣，保持罐中無氧環(huán)境。

1.2.3 利用纖維床生物反應(yīng)器系統(tǒng)進行丁酸發(fā)酵

纖維床生物反應(yīng)器的制作方法見文獻[3］。本文設(shè)計的纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵系統(tǒng)由一個5 L的機械攪拌式預發(fā)酵罐、1～4個500 mL的相互串聯(lián)或并聯(lián)連接的纖維床生物反應(yīng)器以及pH控制器、循環(huán)水保溫系統(tǒng)、供氮氣瓶等組成。纖維床生物反應(yīng)器和罐體構(gòu)成一個循環(huán)回路(見圖1)。整個發(fā)酵系統(tǒng)在121℃下滅菌30 min，通無菌氮氣使罐內(nèi)達到厭氧狀態(tài)，接入100 mL種子液于5 L發(fā)酵罐內(nèi)(裝液量為2 L)，攪拌轉(zhuǎn)速控制在 150 r/min，溫度 37℃，維持pH6.0。待發(fā)酵罐中OD值達到4.0時即開啟纖維床生物反應(yīng)器，初始循環(huán)速度為60 mL/min，12 h后，流速提高到120 mL/min。

圖1 多柱并聯(lián)固定化發(fā)酵裝置圖

以葡萄糖為碳源進行了多柱串并聯(lián)纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)丁酸的動力學研究。批次發(fā)酵時每當發(fā)酵液中碳源濃度接近0時，即放料并補入無菌新鮮培養(yǎng)基進行下一批次發(fā)酵。補料發(fā)酵是當碳源濃度接近0時，補入高濃度葡萄糖液，直至丁酸產(chǎn)量不再提高。

在以上基礎(chǔ)上，進行以木薯渣水解液為碳源的纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)丁酸的動力學研究。在批次發(fā)酵過程中，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時即補入以木薯渣水解液為碳源的新鮮培養(yǎng)基。補料發(fā)酵時，每當碳源濃度接近0時即補入濃縮的木薯渣水解液。每隔4h取樣檢測細胞濃度、底物濃度以及產(chǎn)物含量。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體含量測定

用分光光度計測定600 nm下的吸光值。

1.3.2 還原糖含量測定

將發(fā)酵液10000 r/min離心5 min后稀釋20～100倍，采用DNS法測定其中的還原糖含量。

1.3.3 丁酸和乙酸測定

采用安捷倫6820型氣相色譜系統(tǒng)檢測，以內(nèi)標法定量分析發(fā)酵液中丁酸和乙酸濃度。發(fā)酵液經(jīng)10000 r/min離心后取上清液1 mL，加入內(nèi)標物丙酸30 μL，進樣量0.4 μL，檢測所用流動相為高純氮氣，色譜柱為HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.32 mm)，檢測器為氫火焰離子化檢測器，流速為3 mL/min。測定條件:柱溫250℃，F(xiàn)ID檢測器，進樣口溫度250℃。

2 結(jié)果和討論

2.1 多柱串并聯(lián)固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸工藝研究

生物丁酸只能利用酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)等厭氧微生物經(jīng)厭氧發(fā)酵獲得。固定化發(fā)酵被證實能有效降低發(fā)酵成本并大幅提高厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物終濃度。美國俄亥俄州立大學的楊尚天教授等人在傳統(tǒng)的填充床反應(yīng)器(packed bed reactor，PBR)的基礎(chǔ)上設(shè)計出一種簡單、高效的纖維床生物反應(yīng)器，適用于厭氧性微生物發(fā)酵。但是，目前這種反應(yīng)器的應(yīng)用僅限于實驗室小規(guī)模(反應(yīng)器體積小于1 L)，若單純放大體積，將無法解決復雜的多相傳質(zhì)問題和填充物強度不足等問題。本文嘗試在此基礎(chǔ)上，通過數(shù)個纖維床生物反應(yīng)器的串聯(lián)或并聯(lián)，以提高固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的反應(yīng)效率。

所謂的串聯(lián)是前一個纖維床生物反應(yīng)器的物料出口與下個纖維床生物反應(yīng)器的物料進口依次連接，形成串聯(lián)式纖維床生物反應(yīng)器;而并聯(lián)是所有纖維床生物反應(yīng)器的物料進口并聯(lián)成一個共同的物料進口，所有纖維床生物反應(yīng)器的物料出口并聯(lián)形成一個共同的物料出口，形成并聯(lián)式纖維床生物反應(yīng)器。在各個纖維床生物反應(yīng)器的物料進口和物料出口管道上設(shè)置泵和流量計，將預發(fā)酵罐的出料口與多聯(lián)纖維床生物反應(yīng)器的物料進口相連接，預發(fā)酵罐的進料口與多聯(lián)纖維床生物反應(yīng)器的物料出口相連構(gòu)成封閉循環(huán)系統(tǒng)。實驗中以葡萄糖做碳源分別進行了2～4個纖維床生物反應(yīng)器相互串聯(lián)或相互并聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)丁酸的動力學研究，并與單柱式纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)丁酸進行比較，結(jié)果見圖2。

圖2 多柱串并聯(lián)固定化發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)丁酸結(jié)果比較

從圖2中可以看出，隨著柱子數(shù)量的增加，丁酸終濃度不斷增加，相應(yīng)產(chǎn)率大幅提高。四柱并聯(lián)與單柱發(fā)酵相比，丁酸終濃度提高7.19%，產(chǎn)率提高136.7%。另外，柱子數(shù)量的增加與丁酸得率的增長呈現(xiàn)一定程度的正相關(guān)。這可能是由于固定的菌體占總菌體量比例較大，因而營養(yǎng)物質(zhì)流向細胞生長方向的較少。串聯(lián)模式未能明顯提高發(fā)酵液中丁酸濃度。雙柱并聯(lián)與串聯(lián)相比，產(chǎn)率高出69.32%?？赡苁且驗榇?lián)模式下培養(yǎng)基流動阻力較大，且流動過程中pH值降低造成產(chǎn)酸速率較低。

2.2 木薯渣水解液為碳源四柱并聯(lián)批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸工藝

木薯渣經(jīng)上述預處理得到木薯渣水解液，經(jīng)DNS法測定，其還原糖濃度為55.4 g/L。以木薯渣水解液為葡萄糖的替代碳源，有利于進一步降低發(fā)酵成本。本文以木薯渣水解液為碳源進行了四柱并聯(lián)固定化反復批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸動力學研究，結(jié)果如圖3所示。對全部6個批次的發(fā)酵參數(shù)進行比較，結(jié)果如圖4所示。在6個批次的丁酸發(fā)酵過程中沒有明顯的滯后期，當新鮮培養(yǎng)基加入后，還原糖在30 h左右就被耗盡，丁酸平均濃度達到25.2 g/L，6個批次中丁酸的得率為0.46 g/g。丁酸的發(fā)酵周期平均為32 h。前3個批次周期逐漸縮短，達到穩(wěn)定。這可能是由于前2個批次纖維床生物反應(yīng)器上的菌體固定量還沒有達到最大，隨著批次的增加，菌體密度逐漸增大，生產(chǎn)效率越來越高。利用木薯渣水解液批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸的最高得率達0.52 g/g，超過了酪丁酸梭菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)丁酸的理論得率0.489 g/g。這可能是由于木薯渣水解液中的蛋白質(zhì)等其它營養(yǎng)成分也能轉(zhuǎn)化成為丁酸發(fā)酵的底物。

圖3 以木薯渣水解液為碳源四柱并聯(lián)固定化反復批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸動力學

圖4 木薯渣水解液批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸結(jié)果比較

以木薯渣水解液為碳源固定化批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸的終濃度明顯高于先前報道的以葡萄糖或木糖[13］為碳源的固定化批次發(fā)酵的丁酸終濃度?？赡苁怯捎谀臼碓庖褐泻幸恍┖铣膳囵B(yǎng)基中沒有的、有益于促進發(fā)酵的天然成分，如生長因子等。

與細胞膜過濾回收發(fā)酵相比，該方法解決了發(fā)酵的長期穩(wěn)定性操作問題，避免了膜堵塞和污染問題。同時，使用FBB固定化發(fā)酵系統(tǒng)能夠消除滯后期，同時能夠連續(xù)多批次生產(chǎn)丁酸而不用接種新鮮種子液。由于使用FBB固定化發(fā)酵系統(tǒng)菌體生長較游離時要少，因此獲得了較高的丁酸得率。另外一個可能存在的問題是木薯渣水解液中存在一些較小的不溶的固形顆?？赡軙氯鸉BB中纖維織物之間的孔隙，然而經(jīng)過6個批次的發(fā)酵流速和發(fā)酵情況沒有受到嚴重的影響。這可能是由于填充材料的孔隙足夠讓水解液中的細小顆粒通過。

2.3 木薯渣水解液為碳源四柱并聯(lián)補料發(fā)酵產(chǎn)丁酸工藝

補料發(fā)酵工藝可以增強丁酸梭菌對丁酸的耐受性。并且通過補料提高發(fā)酵液中丁酸的終濃度有利于降低后續(xù)分離成本。采用濃縮木薯渣水解液進行丁酸補料發(fā)酵的動力學研究。結(jié)果如圖5所示。

圖5 以木薯渣水解液為碳源四柱并聯(lián)固定化補料發(fā)酵產(chǎn)丁酸動力學

每當發(fā)酵液中糖的濃度接近于0時，即補入濃縮的木薯渣水解液。隨著補料發(fā)酵的進行，丁酸濃度不斷提高。在發(fā)酵到220 h時，丁酸濃度達到61.4 g/L，遠高于上述批次發(fā)酵中的25.2 g/L。補料初始階段，丁酸濃度增長較快。在丁酸濃度達到40 g/L后得率和產(chǎn)率下降。這說明，隨著發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度的升高，產(chǎn)物抑制作用變得明顯。

使用木薯渣水解液補料發(fā)酵產(chǎn)丁酸的總產(chǎn)率略低于以葡萄糖做碳源時四柱并聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)丁酸，這可能是產(chǎn)物抑制和木薯渣水解過程產(chǎn)生的有害物質(zhì)積累共同作用的結(jié)果。如果我們對木薯渣水解過程可能產(chǎn)生的糖醛酸、酚類等物質(zhì)進行分離，將有可能進一步提高其丁酸發(fā)酵水平。

3 結(jié)論

采用四柱并聯(lián)纖維床生物反應(yīng)器固定化酪丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁酸的發(fā)酵模式是切實可行的。相比于單柱式纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵，其丁酸濃度和產(chǎn)率分別提高7.19%和136.9%。這種模式將有利于解決纖維床生物反應(yīng)器單純體積放大時造成的多相傳質(zhì)問題和填充物強度不足等問題。尤其在后續(xù)中試及工業(yè)化過程中更多纖維床生物反應(yīng)器并聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)丁酸的模式值得繼續(xù)探索。以木薯渣水解液為碳源進行纖維床生物反應(yīng)器四柱并聯(lián)補料發(fā)酵，丁酸終濃度達到61.4 g/L。這一結(jié)果優(yōu)于先前報道的采用葡萄糖[12］、玉米芯水解液[4］、廢糖蜜[5］為碳源時固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的水平。說明木薯渣水解液是一類既成本低廉，又適合于酪丁酸梭菌固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的優(yōu)質(zhì)碳源。

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ABSTRACTAs butyric acid is an important chemical raw material，using cheap non-grain biomass and FBB(fibrous-bed bioreactor)immobilized fermentation to produce butyric acid has important significance.The investigation showed that the four-column parallel immobilized fermentation technology can greatly improve the production efficiency due to the decrease of fermentation recycle to half.In the fermentation with cassava dregs hydrolysate as substrate，25.2 g/L butyric acid was obtained and the yield was 0.46g/g.At last，the production of butyric acid was increased to 61.4g/L through fed-batch fermentation.

Key wordsbrous-bed bioreactor，cassava dregs hydrolysate，butyric acid，fed-batch

Production of Butyric Acid from Casaba Dregs Hydrolysate by Immobilized Clostridium tyrobutyricum in Fibrous-bed Bioreactor

Wang Jin，Cai Jin，Shi Zhou-ming，Huang Lei，Xu Zhi-nan
(Department of Chemical Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

碩士研究生(蔡謹教授為通訊作者，E-mail:caij@zju.edu.cn)。

*國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2009AA02Z206)

2012-04-03，改回日期:2012-05-31